綠豆SSR—PCR反應體系的建立與優(yōu)化

趙雅楠++王穎++張東杰

摘要：為探究影響綠豆SSR-PCR反應的因素，建立綠豆SSR-PCR最佳反應體系，為綠豆遺傳多樣性分析、品種鑒定等提供參考。采用正交設計與單因素試驗聯(lián)合分析法，從Mg2+、Taq酶、引物、dNTPs及模板DNA 5個因素對綠豆SSR-PCR反應體系進行優(yōu)化分析。5個因素中，Mg2+對SSR-PCR結(jié)果影響最大。SSR-PCR反應最佳體系為 20 μL 體系中含0.8 mmol/L Mg2+、1.25 U Taq酶、1.4 μmol/L引物、1.8 mmol/L dNTPs、25 ng模板DNA。該綠豆 SSR-PCR反應體系的建立為進一步利用SSR分子標記技術(shù)研究綠豆資源奠定了基礎。

關(guān)鍵詞：綠豆；SSR-PCR；正交設計；單因素試驗；分子標記技術(shù)

中圖分類號： S643.401文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0023-03

綠豆[Vigna radiata（Linn.）Wilczek]是豇豆屬（Vigna）亞洲豇豆亞屬（Ceratotropis）的主要栽培豆種，是我國的原產(chǎn)作物，有2 000多年的栽培歷史，目前的主產(chǎn)區(qū)集中在內(nèi)蒙古、吉林、黑龍江等地，種植面積和產(chǎn)量均居世界前列。綠豆種子富含淀粉、蛋白質(zhì)、膳食纖維、礦物質(zhì)及維生素等營養(yǎng)素和低聚糖、黃酮等功能成分[1]，同時還是傳統(tǒng)的藥食同源食材，可清毒解暑、降血糖、抗腫瘤等，被譽為糧食中的“綠色珍珠”“濟世糧谷”。然而在長期種植過程中，由于綠豆優(yōu)良親本材料的頻繁交流，導致品種退化、遺傳變異水平降低、新品育種緩慢，使綠豆在國內(nèi)外市場的發(fā)展面臨嚴峻考驗[2]。

近些年，DNA分子標記技術(shù)不斷發(fā)展，為作物育種、遺傳多樣性分析、種子純度鑒定等提供了新途徑。簡單重復序列（simple sequence repeats，簡稱SSR）是廣泛分布于植物基因組中的以1～6個串聯(lián)核苷酸為重復單位的DNA序列，作為第二代分子標記技術(shù)的典型代表，SSR因多態(tài)性豐富、重復性好、標記共顯性等特點[3]，在大豆、玉米、水稻等作物的遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、QTL定位等研究中應用廣泛[4-6]，而目前國內(nèi)基于SSR技術(shù)對綠豆的研究較少，與一些大宗作物相比，綠豆基因組研究還處于落后階段，特別是針對綠豆SSR-PCR體系建立及優(yōu)化的研究鮮有報道。本研究利用正交設計與單因素試驗聯(lián)合分析法對影響綠豆SSR-PCR反應體系的5個因素（Mg2+、Taq酶、引物、dNTPs、模板DNA）進行優(yōu)化，旨在為綠豆SSR標記研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

以綠豆C0633為試材，試材模板DNA由北京市農(nóng)林科學院作物研究所提供。以來源于NCBI的引物VJ31122B（正向：5′-TCACAAAGGGAGGGAAGAGA-3′；反向：5′-CCCCAGGTTGGTTGGTTGGA-3′）為目標引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。植物基因組DNA提取試劑盒、Mg2+、10×buffer、dNTPs、Taq DNA聚合酶等均購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1綠豆基因組DNA提取以新鮮綠豆嫩葉為材料，利用Plant Genomic DNA Kit提取綠豆基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質(zhì)量，利用TBD-3000核酸蛋白檢測儀分析DNA純度與濃度，以確定是否滿足后續(xù)試驗要求，檢測合格后稀釋成30 ng/μL，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2正交設計優(yōu)化采用L16（45）正交設計對Mg2+、Taq酶、引物、dNTPs及模板DNA進行優(yōu)化。總體系為20 μL，除上述變化因素外，每組體系還含有2 μL 10×PCR buffer，其他用ddH2O補齊，每個處理重復2次（表1、表2）。

1.2.3單因素試驗設計在正交設計優(yōu)化的基礎上，對影響SSR-PCR反應體系的部分因素進行單因素分析，進一步優(yōu)化SSR-PCR體系。每個因素設置8個水平，每個梯度處理重復2次（表3），總體系中包含2 μL 10×PCR buffer，其他影響因素濃度參照正交設計中的最優(yōu)組合條件，用ddH2O補齊至20 μL。

1.2.4SSR-PCR擴增及檢測PCR反應在東勝龍ETC-811 PCR儀上進行，參數(shù)為94 ℃預變性5 min，40個循環(huán)（94 ℃ 變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸

8 min，4 ℃下保存。以Low MW DNA Marker-A作對照，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

2結(jié)果與分析

2.1正交試驗結(jié)果分析

由圖1可知，16個處理因Mg2+、Taq酶、引物、dNTPs及模板DNA濃度的不同而導致擴增效果存在明顯差異。其中第4組處理未擴增出條帶，11、12、13組條帶較弱，第3、6、10組處理效果較好，條帶清晰、明亮，未出現(xiàn)明顯拖尾、彌散現(xiàn)象。參照賀石林的統(tǒng)計方法[7]，對2次正交試驗結(jié)果進行獨立打分統(tǒng)計，根據(jù)條帶強弱、背景清晰程度等進行評價，最優(yōu)處理得16分，最差處理得1分，各體系得分分別為9、11，10、10，9、7，1、1，9、10，15、16，10、8，9、9，3、2，16、15，4、3，2、2，4、3，7、7，9、8，7、11。根據(jù)2次評分求出各因素不同水平評分之和T、平均分K以及極差R。在假設不考慮各因素間交互作用的情況下，R值越大，表示該因素對反應體系的影響越大，K越大，則表示反應水平越好[8]。由表4可知，5個因素對 SSR-PCR 反應影響順序依次為Mg2+>Taq酶>dNTPs>引物>DNA模板。

2.2單因素試驗設計優(yōu)化綠豆SSR-PCR體系

2.2.1Mg2+對SSR-PCR反應的影響Mg2+是影響SSR-PCR反應的重要因素之一，通過調(diào)控Taq酶活性影響PCR反應結(jié)果[9]。由圖2可知，單因素優(yōu)化試驗設置的Mg2+濃度梯度范圍內(nèi)均能擴增出條帶，但清晰度、特異性及背景顏色存在差異。Mg2+濃度在0.1～0.5 mmol/L時，擴增條帶較弱、辨識度較低；濃度為0.8～1.0 mmol/L時，擴增條帶清晰、明亮；當濃度大于1.0 mmol/L時，擴增產(chǎn)物量減少，條帶現(xiàn)彌散狀。故最佳反應體系中的Mg2+濃度確定為0.8 mmol/L，與正交優(yōu)化試驗結(jié)果一致。

2.2.2Taq酶對SSR-PCR反應的影響由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，隨著Taq酶用量的增加，擴增條帶逐漸清晰，但達

到一定濃度后，Taq酶用量即成為擴增效果的負相關(guān)因素。Taq酶濃度為0.5 U/20 μL時，未擴增出條帶；濃度為0.75～1.00 U/20 μL時，擴增條帶較弱且穩(wěn)定性較差，結(jié)果不可靠；當Taq酶濃度為1.25 U/20 μL時，條帶清晰、重復性好；而當濃度大于1.25 U/20 μL時，非特異性擴增條帶增多，并出現(xiàn)引物二聚體。綜合上述分析，最佳反應體系中Taq酶用量為1.25 U/20 μL，與正交優(yōu)化試驗結(jié)果相比，Taq酶濃度在最佳組合10與最佳水平之間。

2.2.3dNTPs對SSR-PCR的影響dNTPs是SSR-PCR反應的重要底物，由圖4可知，當dNTPs濃度為0.2～0.8 mmol/L，條帶較暗且有引物二聚體出現(xiàn)；當濃度為1.2、1.5 mmol/L時，引物二聚體消失，條帶逐漸明亮清晰；當濃度達到1.8 mmol/L時，擴增效果最佳。隨著dNTPs濃度繼續(xù)增加，擴增效果差異不大，因此，從節(jié)約材料角度考慮，選擇 1.8 mmol/L 為dNTPs的最佳反應濃度。

3討論

SSR是以PCR反應為基礎的分子標記技術(shù)，分析結(jié)果受PCR擴增效果影響，而PCR反應的擴增情況受諸多因素控制，且不同作物對PCR反應的敏感程度及要求也各不相同，因此建立和優(yōu)化SSR-PCR反應體系是十分必要的。本研究采用正交設計與單因素試驗綜合分析法，對影響綠豆SSR-PCR反應體系的Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物及模板DNA進行優(yōu)化，該法充分利用了正交設計的整齊可比性、均衡分散性、可伸縮及效應明確的優(yōu)點，既解決了單因素設計得到的各因素最優(yōu)水平不一定是最佳組合的矛盾，又避免了試驗量大、周期長等問題，使SSR-PCR的建立和優(yōu)化更加有效、嚴謹。但須指出，對正交優(yōu)化結(jié)果進行直觀分析存在一定主觀成分，因此在接下來的研究中應增加重復試驗次數(shù)，多次評判以減少打分誤差，也可以借助軟件對結(jié)果進行分析。同時本研究在正交試驗中的Mg2+濃度、酶含量、dNTPs濃度都在單因素優(yōu)化試驗的最佳范圍內(nèi)，但結(jié)果并不完全吻合，這可能是因為正交試驗設置的水平梯度間隔較大，也可能是各因素之間存在一定的交互作用，試驗得到的最佳濃度不同。此外，從試驗結(jié)果還可以看出，SSR-PCR反應體系中對因素濃度的要求并不十分精確，即在一定范圍內(nèi)均可得到清晰、穩(wěn)定的條帶。結(jié)合考慮擴增效果及節(jié)約原料等因素，最終得到的最佳體系為（20 μL）：0.8 mmol/L Mg2+、1.25 U Taq酶、1.4 μmol/L引物、1.8 mmol/L dNTPs、25 ng模板DNA。

根據(jù)方差分析可知，Mg2+對SSR-PCR反應體系影響最大，其次是Taq酶，然后依次是dNTPs、引物，模板DNA對體系影響最小。Mg2+是Taq DNA聚合酶的輔助因子，能夠影響酶活性，同時還會與dNTPs產(chǎn)生拮抗作用[10]，對PCR擴增效果的影響主要表現(xiàn)在PCR擴增產(chǎn)物的特異性及產(chǎn)量方面。Taq酶是Mg2+的依賴性酶，濃度過低會導致活性不夠，PCR反應不充分，擴增產(chǎn)物產(chǎn)量少，濃度過高不僅會浪費原料，還會降低PCR反應的特異性，導致擴增條帶難以辨識[11]。dNTPs是PCR反應的重要原料，濃度過高會增加非特異性擴增，濃度過低則可能消耗過快，造成單鏈化，最終導致擴增失敗。引物與模板結(jié)合的特異性及穩(wěn)定性直接影響PCR擴增產(chǎn)率。引物濃度過低，會降低產(chǎn)物產(chǎn)量，濃度過高則會與模板DNA結(jié)合形成二聚體，造成背景彌散、顏色加深[12]。同時，本研究發(fā)現(xiàn)模板DNA對SSR-PCR反應的影響最小，這可能與SSR標記的特點有關(guān)，即少量模板即可滿足反應的需求，

對濃度和數(shù)量要求不嚴。另外，有學者指出，任何形式的DNA和RNA都能夠滿足作為底物的要求，在大多數(shù)的PCR過程中，對DNA模板濃度要求很寬泛，在某適宜濃度范圍內(nèi)即可，本研究結(jié)果與其基本吻合。

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