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    白芨ISSR—PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

    2017-01-19 13:03:42吳利玲
    關(guān)鍵詞:單因素試驗(yàn)白芨正交試驗(yàn)

    吳利玲

    【摘 要】 目的:對(duì)白芨ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行建立以及優(yōu)化。方法:采用正交試驗(yàn)對(duì)影響白芨的ISSR-PCR反應(yīng)體系中的6個(gè)影響因素Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+進(jìn)行系統(tǒng)的篩選和優(yōu)化,尋找白芨ISSR-PCR的最優(yōu)條件。結(jié)果:經(jīng)過系統(tǒng)的優(yōu)化后,最終確立了最優(yōu)的白芨ISSR-PCR方案,50 μL反應(yīng)液中Taq DNA聚合酶為2.5U、BSA為7.5g/L、引物為5.0μmoL/L、模板DNA為200ng、dNTP為0.4mmoL/L、Mg2+為4.0mmoL/L。結(jié)論:試驗(yàn)結(jié)果得出最佳的白芨ISSR-PCR反應(yīng)體系,為后期合理有效的應(yīng)用ISSR方法對(duì)白芨遺傳資源的監(jiān)測提供了參考。

    【關(guān)鍵詞】 白芨;ISSR-PCR反應(yīng)體系;單因素試驗(yàn);正交試驗(yàn)

    【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517(2016)24-0028-03

    白芨屬蘭科,其性味甘、苦、澀,微寒,主要?dú)w經(jīng)于肺[1]。白芨現(xiàn)已成為瀕臨滅絕的珍貴物種,對(duì)白芨遺傳資源的分類保護(hù)已成為人類研究的重大課題之一[2]。ISSR是近年來新興的一種分子標(biāo)記技術(shù),在植物遺傳資源的保育工作中已得到普及使用[3]。PCR擴(kuò)增為ISSR的關(guān)鍵技術(shù),主要受到6個(gè)因素的影響(Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+)[4]。研究采用單因素試驗(yàn)以及正交試驗(yàn)對(duì)影響白芨的ISSR-PCR反應(yīng)體系中的6個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化,尋找白芨ISSR-PCR反應(yīng)體系的最優(yōu)條件。

    1 材料與方法

    1.1 材料 白芨購自同仁堂,購得的白芨放置在干燥陰涼處儲(chǔ)存。

    1.2 主要試劑與儀器 Taq DNA聚合酶、dNTP、100 bp DNA Ladder、BSA、Mg2+均購自克勞寧(北京)生物科技有限公司。PCR擴(kuò)增儀(PTC.200,美國MJ公司)、核酸檢測儀(Bio Photometer,美國Eppendoff公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 DNA的提取 白芨基因組DNA的提取方法為改進(jìn)的CTAB法,并用核酸檢測儀測定獲得的DNA濃度,并用蒸餾水稀釋濃度為0.05g/L,放置在-20℃冰箱中儲(chǔ)存。

    1.3.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件及其產(chǎn)物檢測 參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,退火溫度選擇52℃,PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下:4min預(yù)變性于94℃條件下,30s變性于94℃條件下,1min退火于52℃條件下,90s延伸于72℃條件下,共重復(fù)35次操作。取6μL所獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,行1h的電脈操作。用100 bp DNA Ladder作為參照物,1×TAE為緩沖液,5 V/cm恒壓條件,瓊脂糖凝膠為2.0%。

    1.3.3 優(yōu)化方法 正交設(shè)計(jì)選取L25(56)的方案,反應(yīng)液為50μL,結(jié)果見表1。由正交實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果,選取數(shù)目多且清晰條帶的組合。

    1.3.4 正交實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照優(yōu)化后的方法行三次ISSR-PCR反應(yīng),分析所測定的條帶情況。

    2 結(jié)果

    2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 6因素5水平的正交設(shè)計(jì)共產(chǎn)生25個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物,結(jié)果見表2。Taq DNA:由電脈圖分析可得,當(dāng)Taq DNA為2.5U時(shí)條帶數(shù)目最多,且最清晰。BSA:由組別4的條件得到的電脈圖分析可知,選擇7.5g/L為BSA的最優(yōu)濃度。引物:從正交試驗(yàn)結(jié)果可知,當(dāng)引物濃度為5.0 μmoL/L時(shí)電脈圖條帶數(shù)目最多、最清晰。DNA模板:按不同的濃度進(jìn)行加樣,其它因素均設(shè)為正交試驗(yàn)的最優(yōu)條件,由電脈圖可知,200ng為最適濃度。dNTP及Mg2+:分別按不同的濃度進(jìn)行加樣,其它因素均設(shè)為正交試驗(yàn)的最優(yōu)條件,分析圖譜,得出最優(yōu)值。

    2.2 正交實(shí)驗(yàn)直觀分析及方差分析 由表2、3可知,最優(yōu)的白芨ISSR-PCR方案,50μL反應(yīng)液中Taq DNA聚合酶為2.5 U、BSA為7.5g/L、引物為5.0μmoL/L、模板DNA為200ng、dNTP為0.4mmoL/L、Mg2+為4.0mmoL/L。結(jié)果分別見表2、表3。

    2.3 正交實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 正交實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,優(yōu)化后的方案穩(wěn)定、可行。具體結(jié)果見表4。

    3 討論

    白芨具有消腫止痛以及收斂止血的功效,臨床主要用于肺結(jié)核,百日咳,矽肺,十二指腸潰瘍急性穿孔,十二指腸潰瘍出血等疾病的治療[5]。如今,白芨已成為瀕危物種,對(duì)其進(jìn)行有效的育種至關(guān)重要,加之不同的白芨很難采用形態(tài)特征進(jìn)行區(qū)分,而分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)遺傳資源的保育十分重要[6]。隨著科技的進(jìn)步,人類對(duì)生物體的認(rèn)識(shí)已經(jīng)上升到微觀水平。通過測定微觀分子的水平的線性結(jié)構(gòu)(如DNA序列),來橫向比較不同物種的差異[7]。ISSR簡單易行,普遍應(yīng)用于物種區(qū)分、遺傳資源保育等領(lǐng)域。具有檢測成功率高、成本較低等特點(diǎn)。ISSR技術(shù)可在預(yù)先不知序列信息的前提下,能夠僅用一條引物以及基因組中眾多的簡單重復(fù)序列就可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]。

    PCR擴(kuò)增為ISSR的重要技術(shù),主要的影響因素為Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+。故每個(gè)白芨物種都要制定不一樣的ISSR-PCR條件。由于單因素試驗(yàn)對(duì)所考察的因素水平進(jìn)行逐一分析,任務(wù)量過大,操作過于繁瑣,且無法考察各因素相互的影響作用,故本研究不予單獨(dú)采用。正交試驗(yàn)可全面考察各因素之間的相互影響作用,且能分析各因素之間的輕重次序。正交試驗(yàn)的缺點(diǎn)為測定結(jié)果精密度較差,且對(duì)技術(shù)水平要求過高。正交試驗(yàn)與單因素試驗(yàn)具有互補(bǔ)的作用,故本研究將兩者結(jié)合的試驗(yàn)方法進(jìn)行優(yōu)化。最終對(duì)影響ISSR-PCR反應(yīng)體系的Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+因素進(jìn)行系統(tǒng)篩選,得到了最優(yōu)的反應(yīng)條件(50 μL反應(yīng)液中Taq DNA聚合酶為2.5 U、BSA為7.5g/L、引物為5.0μmoL/L、模板DNA為200ng、dNTP為0.4mmoL/L、Mg2+為4.0mmoL/L)。本實(shí)驗(yàn)在不設(shè)重復(fù)時(shí),試驗(yàn)隨機(jī)誤差分散式隱含在正交表各列之中,由于隨機(jī)誤差與模型誤差相對(duì)混雜,而且較大,至使F檢驗(yàn)的誤差均方差相對(duì)較大。

    綜上所述,試驗(yàn)結(jié)果得出最佳的白芨ISSR-PCR條件,為ISSR技術(shù)在白芨物種鑒別方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    參考文獻(xiàn)

    [1]卓微偉. 中藥白芨的藥理作用及臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 北方藥學(xué), 2014,(11):69.

    [2]陳燦, 陳海霞. 白芨繁殖研究進(jìn)展[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015,(5):135-137.

    [3]王建波. ISSR分子標(biāo)記及其在植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 遺傳, 2002, 24(5):613-616.

    [4]余艷, 陳海山, 葛學(xué)軍. 簡單重復(fù)序列區(qū)間(ISSR)引物反應(yīng)條件優(yōu)化與篩選[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2003, 11(1):15-19.

    [5]陶阿麗, 金耀東, 劉金旗,等. 中藥白芨化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013,(11):6-9.

    [6]和志嬌, 呂麗芬, 楊麗云,等. 白芨種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 21(4):1081-1085.

    [7]郭峰. 分子生物學(xué)技術(shù)及與其他學(xué)科的關(guān)系[J]. 河南科技, 2011,(4):9.

    [8]劉亭, 金露, 蘭波,等. 白芨ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J]. 貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2014, 39(4):455-458.

    (編輯:陶希睿)

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