LC-MS/MS 法測定注射劑中來自生產(chǎn)管路中的PFOA 和PFOS 的遷移量

張曉蕓，張建茹，崔 萍，昝艷楠，曹慶豐，丁逸梅，*

1 南京工業(yè)大學(xué)江蘇省藥物研究所，南京 210009；2 南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，南京211816

注射劑生產(chǎn)管路常選用材質(zhì)為聚四氟乙烯，其具有耐酸、耐堿及高度的化學(xué)穩(wěn)定性[1]，聚四氟乙烯在聚合生產(chǎn)時添加全氟辛酸（PFOA）等含氟類化合物，含氟系列產(chǎn)品經(jīng)化學(xué)或生物降解最終產(chǎn)生全氟辛基磺酸（PFOS）。PFOA 和PFOS 具有多種毒性，包括生殖毒性、誘變毒性、發(fā)育毒性和神經(jīng)毒性，且在生物體內(nèi)儲蓄難以代謝。在注射液制備工藝中當注射液流經(jīng)聚四氟乙烯管路或密封件時，PFOA 和PFOS 可能會被溶出遷移至注射液中，且藥液與管路的接觸面積、接觸時間較難評估，因此直接考察注射液藥品中PFOA 和PFOS 的遷移量尤為重要。

PFOA 和PFOS 的檢測手段目前有如下幾種：

②GC/MS 法：PFOA 和PFOS 為強酸性，揮發(fā)性較小，呂剛等[9]以乙酰氯為衍生化試劑得到PFOA甲酯和全氟葵酸（PFDA）甲酯測定PFOA；魏琳琳[10]，用碳基固體酸作衍生化試劑，N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）為脫水劑，生成PFOA 甲酯。夏靜芬等[11]以2，4-二氟苯胺為衍生劑，N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）為脫水劑與全氟羧酸類（PFCAs）形成酰胺衍生產(chǎn)物；張穎等[12]，以四丁基氫氧化銨為衍生化試劑，超聲輔助與PFOA 生成銨鹽。

③LCMS 或LCMS/MS 法： 高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法是目前最為廣泛應(yīng)用的檢測PFOA 和PFOS 的定量分析方法。在食品及食品包裝材料[13，14]、生物組織[15，16]、藥品[17]中關(guān)于PFOA 和PFOS 的報道較多。

歐盟及美國FDA 明文規(guī)定材料及食品包裝材料中PFOA 和PFOS 的使用限量，但我國現(xiàn)行法規(guī)暫未明文規(guī)定PFOA 和PFOS 在藥品中的限量。本文依據(jù)一般遺傳毒性致癌物的SCT 值，即PFOA 和PFOS 在藥品中每日攝入總量設(shè)定宜低于1.5 μg。

本實驗使用LC-MS/MS 法測定注射劑中來自藥品生產(chǎn)管路的PFOA 和PFOS 含量，通過標準加入法能夠消除注射劑復(fù)雜基體效應(yīng)對PFOA 和PFOS 測定的影響，得到有效數(shù)據(jù)，從而準確、簡便、快速地測定PFOA 和PFOS 的遷移量。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Waters Quattro Micro 三重四極桿質(zhì)譜儀，Waters 2695 液相色譜儀（沃特斯中國有限公司），含在線真空脫氣機、四元梯度泵、恒溫自動進樣器、柱溫箱、電噴霧離子源（ESI）；Masslynx4.0 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)；XP105DR 十萬分之一電子天平（美國Mettler 公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用甲磺酸萘莫司他 （規(guī)格10 mg，批號：2181202、2181203、2 181204；規(guī)格50 mg，批號：2181205、2181206、2190101）；吸入用乙酰半胱氨酸溶液（規(guī)格3 mL∶0.3 g，批號：170801、170802、170901）；注射用特利加壓素?zé)o菌稀釋劑 （規(guī)格5 mL ∶45 mg，批號：191101、191102、191103）；注射用氨磷汀（規(guī)格0.5g，批號：S200107、S200110、S200114A、S200114B、S200114C）；PFOA 對照品 （Sigma-Aldrich 公司，純度95%，批號：WXBD1156V）；PFOS 對照品（Dr.Ehrenstorfer 公司，批號：1015577）。甲醇（Merck 公司，色譜純）；乙酸銨（Sigma-Aldrich 公司）；水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 LC-MS 條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充柱（Kromasil C8，100A 150mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.01 mol·mL-1乙酸銨-乙腈（50∶50）；流速：1.0 mL·min-1，分流進樣；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。

王榮（1984.05-），女，上海，國家建筑信息模型（BIM）產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟助理研究員/經(jīng)濟師，南京工業(yè)大學(xué)經(jīng)濟與管理學(xué)院工程管理專業(yè)在職碩士研究生，研究方向：建筑產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化，工程建設(shè)標準化、建筑信息模型BIM。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），負離子模式檢測；毛細管電壓：3.0kV；錐孔電壓：30V；源溫：120℃；脫溶劑區(qū)溫度：350℃，碰撞氣（氬氣）；壓力：1.0×10-4mbar；脫溶劑氣流速：400 L·h-1；氣簾氣流速：50 L·h-1。

2.2 溶液配制

PFOA 對照品溶液： 取PFOA 對照品10 mg，精密稱定，置100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL 含PFOA 100 μg 的儲備液；精密量取該溶液1.0 mL，置50mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成1 mL 含PFOA 2 μg 的溶液。

PFOS 對照品溶液：取PFOS 對照品10 mg，精密稱定，置100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL 含PFOS 100 μg 的儲備液；精密量取該溶液1.0 mL，置50 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成1 mL 含PFOS 2 μg 的溶液。

PFOA 與PFOS 混合對照品溶液： 精密量取PFOA 2 μg·mL-1的對照品溶液、PFOS 2 μg·mL-1的對照品溶液各1.0 mL，置200 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL 含PFOA 與PFOS 的500 ng 混合對照品溶液。

①標準曲線法： 分別精確量取PFOA 和PFOS混合對照品溶液（0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL）置50 mL量瓶中，使用甲醇稀釋至刻度，搖勻。此標準溶液系列I 中的PFOA 和PFOS 質(zhì)量濃度分別為5、10、20、30、50 ng·mL-1。

②標準加入法：A.注射凍干粉末：此標準溶液系列I 中的PFOA 和PFOS 質(zhì)量濃度分別為5、10、20、30、50 ng·mL-1；取注射用凍干粉末1 瓶，分別精密加入標準曲線溶液5 mL，混合均勻，過濾，此標準溶液系列Ⅱ中的PFOA 和PFOS 質(zhì)量濃度分別為5、10、20、30、50 ng·mL-1。B.注射液：分別精確量取PFOA和PFOS 混合對照品溶液（0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL）置50 mL 量瓶中，分別加入注射液5 支，使用甲醇稀釋至刻度，搖勻。此標準溶液系列Ⅲ中的PFOA 和PFOS 質(zhì)量濃度分別為5、10、20、30、50 ng·mL-1?？瞻兹芤海喝∽⑸溆脙龈煞勰┗蛘咦⑸湟?，用甲醇稀釋至一定倍數(shù)，搖勻，作為空白溶液（必要時使用有機尼龍膜過濾）。

2.3 專屬性試驗

精密量取“2.2”中PFOA 與PFOS 混合對照品溶液、空白溶液各20 μL，注入液相色譜儀測定，結(jié)果見圖1、圖2，由圖2 可見，空白溶液對測定無干擾。

2.4 線性及靈敏度試驗

將配制好的標準曲線法標準溶液和標準加入法標準溶液，在同樣的LC/MS 條件下測定，從而獲得PFOA 和PFOS 兩種線性?；貧w方程、相關(guān)系數(shù)見表1。

結(jié)果兩種方法的PFOA 和PFOS 工作曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0。說明標準曲線法和標準加入法的PFOA 和PFOS 濃度與響應(yīng)均呈線性關(guān)系。

在同樣的LC/MS 檢測條件下，比較標準加入和未加入樣品基體的檢測限和定量限，見表2。由于樣品的基體不同，PFOA 和PFOS 在ESI 源中的響應(yīng)被抑制或者增敏，其程度與注射劑的基體有關(guān)。

表1 PFOA 和PFOS 回歸方程與相關(guān)系數(shù)

表2 PFOA 和PFOS 的檢測限和定量限

2.5 回收率試驗

2.5.1 注射凍干粉末 精密量取PFOA 和PFOS 混合對照品溶液適量，用甲醇稀釋制成每1 mL 中分別含PFOA 和PFOS（5、20、30 ng·mL-1）的溶液；取注射用凍干粉1 瓶，精密加入溶液5 mL，混合均勻，過濾。

2.5.2 注射液 分別精確量取PFOA 和PFOS 混合對照品溶液（0.5、2.0、3.0mL）置50mL 量瓶中，分別加入注射液5 支，使用甲醇稀釋至刻度，搖勻。制備成PFOA和PFOS 質(zhì)量濃度分別為5、20、30 ng·mL-1的溶液。

分別采用標準曲線法和標準加入法，進行回收率試驗，結(jié)果見表3、表4。

使用標準曲線法PFOA 回收率在60%附近，PFOS的回收率在180%附近，RSD 均小于10%，說明PFOA和PFOS 受樣品基體的干擾，但平行性較好；使用標準加入法，PFOA 和PFOS 的回收率均在80%～120%，RSD 均小于10%，得到了有效數(shù)據(jù)，說明標準加入法能夠消除樣品基體對PFOA 和PFOS 測定的干擾。

為了驗證本試驗的設(shè)想，選取5 個不同規(guī)格的注射劑品種，分別采用標準加入法進行回收率試驗，均得到良好的數(shù)據(jù)，結(jié)果見表5。PFOA 回收率在93.49%～110.9%，PFOS 的回收率在 87.57%～101.6%，RSD 均小于10%，結(jié)果符合驗證要求。

表3 PFOA 回收率試驗

表4 PFOS 回收率試驗

2.6 樣品測定及結(jié)果

采用標準加入法測定4 個項目下來自生產(chǎn)管路中遷移的PFOA 和PFOS 的含量，結(jié)果均未檢出。

3 討論

3.1 定量離子的選擇

PFOA 和PFOS 選用m/z 368.9783 作為PFOA的檢測離子；PFOS 選用m/z 498.9298 作為PFOS 的檢測離子[17]。

3.2 樣品前處理篩選

在注射劑中，PFOA 和PFOS 限度為1.5 μg·d-1，樣品可供稀釋的倍數(shù)限于5 倍或者10 倍，樣品溶液中有機物含量較高，干擾PFOA 和PFOS 的檢測。選擇合適的樣品前處理排除干擾，是實驗解決問題的關(guān)鍵點。文獻報道樣品前處理主要有4 種：①固相萃取[18]，成本高，回收率低；②液液萃取[19]，基本采用甲基叔丁基醚為萃取溶劑，操作繁瑣，但能夠得到較好的回收率。③索氏提取[20]，應(yīng)用于土壤、食品、生物樣品等，常用的溶劑包括：乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、二氯甲烷以及甲醇；④柱前衍生化[2-12]，周期較長，操作繁瑣。

表5 不同注射劑回收率試驗（%）

本實驗嘗試了液液萃取方式，使用溶劑：正己烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、二氯甲烷。PFOA 和PFOS 具有一定的水溶性，萃取效率較低，操作繁瑣；后采用甲醇稀釋樣品，并使用有機尼龍膜過濾。

3.3 標準曲線法和標準加入法比較

本實驗先考察標準曲線法，發(fā)現(xiàn)PFOA 回收率在60%附近偏低，PFOS 的回收率在180%附近偏高，不符合《中國藥典》2015 版通則9101 藥品質(zhì)量標準分析方法“驗證指導(dǎo)原則”中驗證的要求；后采用標準加入法，結(jié)果良好，說明標準加入法可消除注射劑品種復(fù)雜基體干擾問題，避免使用操作繁瑣的萃取方式，從而準確、簡便、快速地測定了注射劑中來自生產(chǎn)管路的PFOA 和PFOS 的遷移量。