對苯二酚對海洋底棲雙殼類毛蚶和紫貽貝毒性效應(yīng)研究

毛成責(zé)，魏愛泓*，姜晟，周超凡，矯新明，袁廣旺，鄭江鵬，王長友

(1.江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇省海洋環(huán)境監(jiān)測預(yù)報中心，江蘇 南京 210019；2.江蘇省海涂研究中心,江蘇 南京 210036；3. 南京信息工程大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210044)

隨著人類工業(yè)的不斷發(fā)展，苯系物及其衍生物被廣泛開發(fā)并運(yùn)用到人類生產(chǎn)活動中，給人們的生產(chǎn)和生活帶來了很多便利，但同時這些有毒有害化合物也通過生產(chǎn)和生活廢水、廢氣、爆炸和泄露等途徑被大量排入土壤、水及大氣環(huán)境中，給生態(tài)系統(tǒng)和人類健康帶來了不利影響[1-2]。

對苯二酚是一種常見的苯系物，也是苯的主要代謝物，溶于水，易溶于乙醇和乙醚，被廣泛應(yīng)用于攝像造影劑、染料中間體、橡膠及食品抗氧化劑、機(jī)動車燃料、美白化妝品及除藻劑等眾多生產(chǎn)生活領(lǐng)域，故其在生態(tài)系統(tǒng)中的分布相當(dāng)廣泛[1，3-4]。國內(nèi)外大量研究表明，酚類化合物在10-6級就會對水生生物產(chǎn)生極大毒性，在10-9級就能影響魚類和甲殼類的感覺器官[5-6]。而對苯二酚則對鏈帶藻屬(Desmodesmusspp.)、集胞藻屬(Synechocystisspp.)、念珠藻屬(Nostocspp.)、銅綠微囊藻(Microcystisspp.)、褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)、大型溞(Daphniamagna)、黑頭呆魚(Pimephalespromelas)、斑馬魚屬(Brachydaniosp.)等多種水生生物具有極強(qiáng)毒性[3,7]。

江河水體中的對苯二酚最終將匯入海洋，其作為普通化工產(chǎn)品出現(xiàn)在國際海運(yùn)貨物中。近年來海上化學(xué)品泄漏事故多有發(fā)生，海洋生物因此遭受來自陸源和海上的雙重威脅，海洋底棲生物等遷移能力較弱的類群將受到較大影響[8-9]。現(xiàn)選取毛蚶(Scapharcasubcrenata)、紫貽貝(Mytilusedulis)為受試生物，通過急性和慢性毒性試驗，分析計算對苯二酚對兩者的半致死效應(yīng)濃度(Lethal Concentration 50，LC50)、非檢測效應(yīng)濃度(No Detected Effective Concentration，NDEC) 及無觀測效應(yīng)濃度(No Observed Effective Concentration，NOEC)，為對苯二酚的海洋生態(tài)風(fēng)險管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑

用海水素(益爾牌)配制鹽度為20 pus的人工海水，放置1 d后，作為受試生物培養(yǎng)液；對苯二酚為分析純(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2 受試生物預(yù)處理

采集連云港贛榆區(qū)近岸健康且反應(yīng)靈敏的毛蚶與紫貽貝，以半靜水法暫養(yǎng)3～7 d，期間連續(xù)充氣，每24 h更換水體的一半；經(jīng)3 d饑餓處理后，第4 d開始每天以貝類軟體鮮重的0.6%(約0.1%～0.2%的濕重)投喂螺旋藻粉，至試驗前1 d停止投餌[10-11]。試驗中選擇大小基本一致、健康且反應(yīng)靈敏的個體隨機(jī)分組。

1.2 試驗方法

1.2.1 急性毒性試驗

在玻璃水槽(37cm×27 cm×20 cm)內(nèi)注入培養(yǎng)液5 L，隨機(jī)投放經(jīng)24 h饑餓處理的毛蚶/紫貽貝15只。其中，毛蚶平均體長2.28 cm(2.16～2.40 cm)，平均體質(zhì)量4.0 g(3.8～4.5 g)；紫貽貝平均體長5.20 cm(5.06～5.42 cm)，平均體質(zhì)量14.2 g(13.1～15.5 g)；年齡約10個月。試驗期間室溫為14～22℃，水溫為17～21℃，人工海水pH值為7.8～8.0， 溶解氧為9.0～10.2 mg/L。

在預(yù)試驗結(jié)果基礎(chǔ)上設(shè)5個對苯二酚濃度梯度(C1—C5)，天然海水做空白對照(C0)，每組設(shè)雙平行(表1)。進(jìn)行96 h急性毒性試驗，每24 h更換一半水體，補(bǔ)充試劑至初始濃度并記錄死亡率，死亡界定參考《GB/T 29881—2013》[11]。

表1 毒性效應(yīng)試驗對照組及處理組對苯二酚濃度 mg/L

1.2.2 慢性毒性試驗

在水槽中隨機(jī)投放與急性試驗相同處理的毛蚶、紫貽貝各40只。毛蚶平均體長2.85 cm(2.78～2.92 cm)，平均體質(zhì)量7.2 g(6.7～7.8 g)；紫貽貝平均體長5.05 cm(4.85～5.15 cm)，平均體質(zhì)量12.8 g(11.5～14.0 g)。

根據(jù)急性試驗結(jié)果設(shè)置5個對苯二酚濃度梯度和1個海水空白對照，每組雙平行(表1)。每天于固定時間投喂螺旋藻粉1次(投喂量與預(yù)處理相同)，其余條件同急性試驗。于試驗開始第5，9，13，17和21 d及結(jié)束時，測定個體濕重(精度0.01 g)和體長(精度0.01 mm)。

試驗開始后第4，8，12，16和20 d取樣，每組隨機(jī)抽取2只，用于測定蛋白質(zhì)含量及SOD活性，期間觀察各組有無個體死亡。

1.2.3 消化腺SOD活性檢測

取受試生物消化腺，冰浴勻漿，4℃離心后取上清液，按試劑盒說明書(WST-8法)嚴(yán)格操作。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

1.3.1 LC50

LC50是指在一定時間內(nèi)，實驗系統(tǒng)中或某一生態(tài)系統(tǒng)中50%的實驗生物或某一生物種群表現(xiàn)出可觀察到死亡時污染物濃度[12-14]。

采用Log-logistic模型計算LC50及其置信區(qū)間[15]。

(1)

式中：LC50——半致死濃度，mg/L；

y——效應(yīng)指標(biāo)；

c——污染物質(zhì)量濃度；mg/L；

a和b——模型形狀參數(shù)。

1.3.2 非效應(yīng)濃度

1.3.2.1 NOEC

NOEC是指與空白對照無顯著性差異的最高實驗濃度(顯著性水平α通常取5%)[12,15]。研究應(yīng)用單因素方差分析檢驗慢性毒性試驗各組組間方差與組內(nèi)方差的顯著性；應(yīng)用配對多重比較(Games-Howell和Dunnett’s T3)檢驗處理組與對照組的均數(shù)差異，根據(jù)檢驗結(jié)果確定受試生物慢性毒性實驗的NOEC。

1.3.2.2 低效應(yīng)濃度

ECx是指與空白對照相比，能使效應(yīng)指標(biāo)(如生存率、生物量、生長率等)減少x%的污染物濃度[12]。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)、國際環(huán)境毒理學(xué)和化學(xué)學(xué)會(International Society For Environmental Toxicology And Chemistry，SETAC)建議用EC05或EC10置信區(qū)間的下限作為生態(tài)安全暴露基準(zhǔn)濃度[16-17]。

采用Log-logistic模型計算受試生物EC05及其置信區(qū)間。

(2)

式中：y——效應(yīng)指標(biāo)；

c——污染物濃度，mg/L;

x——效應(yīng)百分?jǐn)?shù)；

a——c=0時的效應(yīng)指標(biāo)；

ECx——低效應(yīng)濃度，mg/L；

b——模型形狀參數(shù)。

1.3.2.3 閾值濃度

應(yīng)用weibull毒性效應(yīng)閾值模型計算受試生物急性毒性效應(yīng)閾值濃度[18]。

y=y0e-a(cb-csb)

(3)

式中：y——效應(yīng)指標(biāo)；

c——污染物濃度；mg/L；

Cs——閾值濃度，mg/L;

y0——c=0時的效應(yīng)指標(biāo)；

a和b——模型形狀參數(shù)。

2 結(jié)果分析

2.1 急性毒性效應(yīng)

以對苯二酚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，96 h存活個體數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制毛蚶與紫貽貝存活個體數(shù)變化曲線。結(jié)果表明，對苯二酚對毛蚶與紫貽貝具有一定毒性，ρ>0.2 mg/L即造成毛蚶死亡，>20 mg/L在96 h內(nèi)致半數(shù)毛蚶死亡[ρ(96 h LC50)=20 mg/L]；ρ>2 mg/L即造成紫貽貝死亡，ρ>80 mg/L在96 h內(nèi)致半數(shù)紫貽貝死亡[ρ(96 h LC50)=80 mg/L]，見圖1(a)(b)。

圖1 毛蚶、紫貽貝96 h存活數(shù)隨對苯二酚質(zhì)量濃度變化曲線

2.2 體長及體重變化

第0，5，9，13，17和21 d毛蚶、紫貽貝平均體質(zhì)量、平均體長測量結(jié)果顯示，處理組與對照組組內(nèi)與組間無顯著差異(P>0.1)。

對比試驗21 d和試驗0 d毛蚶的平均體質(zhì)量變化情況，C0組(0 mg/L)、C1組(0.2 mg/L)21 d比0 d略有增長，其余各組均略有下降，其中C5(1.0 mg/L)降幅較明顯；對比試驗21 d和試驗0 d時毛蚶平均體長變化情況可知，除C2(0.4 mg/L)組21 d比0 d略有增長，其余各組均略有下降，其中C3(0.6 mg/L)組降幅較明顯，見圖2(a)(b)。

圖2 對苯二酚對毛蚶平均體質(zhì)量、平均體長的影響

對比試驗21 d和試驗0 d紫貽貝的平均體質(zhì)量變化情況，C0(0 mg/L)組、C5(1.0 mg/L)組21 d比0 d略有下降，其余各組均略有增長，其中C0(0 mg/L)降幅較明顯；對比試驗21 d和試驗0 d紫貽貝的平均體長變化情況，除C4(0.8 mg/L)組21d比0 d略有增長，其余各組均略有下降，其中C0(0 mg/L)、C2(0.4 mg/L)組降幅較明顯，見圖3(a)(b)。

圖3 對苯二酚對紫貽貝平均體質(zhì)量的影響

2.3 消化腺SOD活性的變化

2.3.1 毛蚶

不同時間點取毛蚶樣本的SOD檢測結(jié)果顯示，各處理組組內(nèi)與組間測定值差異不顯著(P>0.05)，見圖4。

圖4 對苯二酚對毛蚶消化腺SOD活性的影響

多重比較和Dunnett’s T3檢驗顯示，試驗第4 d，C1、C3、C4、C5分別為C0的90.7%，80.3%，98.3%和92.1%，僅C3顯著降低(P<0.05),C2為C0的 108.4%，差異不顯著(P>0.05)；第8d，C1—C5分別為C0的115.4%，107.4%，123.7%，130.9%和115.6%，差異不顯著(P>0.1)；第12 d，C1、C4分別為C0的83.1%和73.5%，C2、C3、C5分別為C0的106.1%、113.5%和116.5%，差異不顯著(P>0.1)；第16d，C3為C0的99.4%，C1、C2、C4、C5分別為C0的118.0%，109.0%，114.8%和113.3%，差異不顯著(P>0.1)；第20 d，C1、C2、C4分別為C0的70.9%，96.1%和72.9%， C3、C5分別為C0的109.9%和107.8%，差異不顯著(P>0.1)。

同組不同時段SOD 活性變化各不相同，C1、C3、C4與C0比值呈減小增大再減小趨勢；C2與C0比值呈逐漸減小趨勢；C5與C0比值呈逐漸增大趨勢。由此可見，高濃度組誘導(dǎo)的SOD 活性積分值大于低濃度組。

2.3.2 紫貽貝

不同時間點取紫貽貝樣本的SOD檢測對苯二酚濃度見圖5。試驗第16 d各處理組組間差異顯著(P<0.05)，其余4次抽檢組內(nèi)與組間差異不顯著(P>0.05)。多重比較與Dunnett’s T3檢驗顯示，第4 d，C1、C2、C4、C5分別為C0的108.3%，105.3%，116.9%和119.3%，C3為C0的 93.6%，差異不顯著(P>0.05)；第8 d，C1、C2、C4、C5分別為C0的83.1%，82.8%，78.4%和89.6%，C3為C0的 107.3%，差異不顯著(P>0.1)；第12 d，C1—C5分別為C0的74.0%，93.2%，70.4%，82.2%和77.1%，差異不顯著(P>0.1)；第16 d，C1為C0的100.4%， C2—C5分別為C0的77.2%，79.2%，58.3%和68.7%，其中C4、C5與C0差異顯著(P<0.05)；第20 d，C1—C5分別為C0的98.4%，94.8%，96.6%，89.9%和87.3%，差異不顯著(P>0.1)。

圖5 對照組與處理組紫貽貝SOD活性變化

同組不同時段 SOD 活性變化亦不相同，C1、C2、C4、C5與C0比值呈先增大后減小趨勢，C3與C0比值呈減小增大再減小趨勢。綜上，高濃度組誘導(dǎo)的SOD 活性積分值小于低濃度組，但響應(yīng)時間高濃度組早于低濃度組。

2.4 毒性效應(yīng)濃度

應(yīng)用模型方程公式(1)—(3)分別計算對苯二酚對毛蚶、紫貽貝的急性毒性效應(yīng)濃度LC50、EC05、Cs及其bootstrap置信區(qū)間，平均吻合度檢驗(Goodness of Fit)較好(R2>0.9)。通過多重比較和Dunnett’s T3檢驗處理組與對照組的均數(shù)差異，根據(jù)檢驗結(jié)果確定NOEC(P< 0.05)，見表2。

表2 對苯二酚對毛蚶和紫貽貝的Cs、LC50、EC05 mg/L

Weibull模型為4參數(shù)，Log-Logistic模型為3參數(shù)，后者收斂性要優(yōu)于前者，且EC05均值均0.36和0.50 mg/L時，對毛蚶、紫貽貝產(chǎn)生明顯毒害作用；LC50檢驗結(jié)果表明，ρ(對苯二酚)分別>34.10和66.50 mg/L時，導(dǎo)致毛蚶、紫貽貝半數(shù)死亡。NOEC檢驗結(jié)果表明，ρ(對苯二酚)分別>0.40和0.60 mg/L時，顯著影響毛蚶、紫貽貝消化腺SOD酶的活性。

3 討論

3.1 對苯二酚的急性毒性

相關(guān)研究表明，對苯二酚對部分細(xì)菌、藻類、橈足類及魚類均具有極強(qiáng)的毒性，對大型溞的ρ(48 h EC50)為0.15 mg/L，對褶皺臂尾輪蟲的ρ(24 h LC50)為0.22～0.28 mg/L，對黑頭呆魚的ρ(LC50)為0.10～0.18 mg/L，對明亮發(fā)光桿菌的毒性分別為鄰苯二酚及間苯二酚100倍和1 000倍[3,5,7,19]。結(jié)果顯示，對苯二酚對毛蚶與紫貽貝的ρ(LC50)分別為34.1與66.5 mg/L，根據(jù)水生生物急性毒性等級分類標(biāo)準(zhǔn)，其對兩者毒性等級均為急性毒性3類[10 mg/L<ρ(LC50)<100 mg/L]，毒性較低，這可能由于毛蚶及貽貝成體對對苯二酚的耐受性高于其他類群生物，同時也說明兩者對于對苯二酚的預(yù)警指示作用較弱，后續(xù)可選擇敏感性較高的貝類幼體或其他類群的底棲動物進(jìn)行進(jìn)一步試驗研究[11,20-22]。

毛蚶與紫貽貝作為常見的污染物毒性試驗受試生物，文獻(xiàn)[23-28]分別就重金屬離子、有機(jī)農(nóng)藥、原油及其提煉物對兩者的急性毒性進(jìn)行了研究。根據(jù)典型的96 h試驗結(jié)果，汞、鎘及石油烴對毛蚶的毒性較大，為急性毒性二類[1 mg/L<ρ(96 hLC50)<10 mg/L]；燃料油WAF、原油DWAF、氯硝柳胺對紫貽貝的毒性最大，為急性毒性一類[ρ(96 h LC50)<1 mg/L]，燃料油DWAF、原油WAF、甲基異硫磷、水胺硫磷對紫貽貝的毒性較大，為急性毒性二類，見表3。

不同的試驗條件和分析計算方法對急性毒性試驗的結(jié)果也存在影響，張艷紅等[25]就汞對毛蚶的急性毒性試驗結(jié)果得出ρ(96 h LC50)為2.07 mg/L，而魏愛泓等[29]的試驗結(jié)果ρ(96 h LC50)為800.0 μg/L，兩者相差1個急性毒性等級。

表3 11種?；穼γ琅c紫貽貝的96 h半致死濃度(96h LC50) mg/L

3.2 對苯二酚的慢性毒性

研究表明，毛蚶、紫貽貝等海洋底棲貝類在受到重金屬、有機(jī)農(nóng)藥、多環(huán)芳烴及海洋石油污染時，污染物在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的活性氧化物(H2O2及ROS等)會對機(jī)體抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生2種效應(yīng)：在污染物濃度較低或暴露初期，代謝產(chǎn)生的活性氧化物會誘導(dǎo)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生SOD、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)等抗氧化酶來清除活性氧化物以避免機(jī)體細(xì)胞受損；隨著污染物濃度升高或暴露時間的延長，抗氧化系統(tǒng)將受到嚴(yán)重脅迫而使抗氧化酶的合成受到抑制[23,32-35]。

毛蚶與紫貽貝在對苯二酚的暴露試驗中SOD活性變化顯示，高濃度誘導(dǎo)積分大于低濃度，且高濃度組SOD的應(yīng)激反應(yīng)要早于低濃度，但劑量—效應(yīng)關(guān)系不明顯，這可能由于SOD的合成除受活性氧化物誘導(dǎo)外，還受水溫、溶解氧及pH值等環(huán)境因子和2種受試生物的耐受能力影響；且對苯二酚對生物細(xì)胞的代謝和遺傳方面均存在著較大的毒性，機(jī)體不同組織及器官抗氧化酶合成機(jī)制也存在一定的差異，具體規(guī)律有待進(jìn)一步研究[33-38]。

對于對苯二酚的海洋生態(tài)風(fēng)險管理，首先要建立保護(hù)各類海洋生物免受其污染損害的閾值濃度，即海水水質(zhì)基準(zhǔn)，包括急性基準(zhǔn)與慢性基準(zhǔn)，分別以急性與慢性毒性試驗數(shù)據(jù)為依據(jù)[39]。由于分布區(qū)域、環(huán)境理化參數(shù)、物種代謝機(jī)制等方面的差異，不同類別海洋生物對對苯二酚的敏感性也有著較大的差異，區(qū)域海洋生物群落甚至生態(tài)系統(tǒng)水平要以海水水質(zhì)為基準(zhǔn)推導(dǎo)，還需要補(bǔ)充浮游植物、浮游動物及魚類等不同營養(yǎng)級以及具有生態(tài)學(xué)代表性種類的急性和慢性毒性試驗數(shù)據(jù)，通過物種敏感度分布法(Species Sensitivity Distribution, SSD)進(jìn)行進(jìn)一步研究[39-40]。

4 結(jié)論

(1)急性毒性試驗結(jié)果表明，對苯二酚對毛蚶、紫貽貝的ρ(NDEC)分別為0.36和0.50 mg/L，ρ(LC50)分別為34.10和66.50 mg/L。

(2)慢性毒性試驗結(jié)果表明，處理組與對照組組內(nèi)與組間體長及體質(zhì)量無顯著差異(P>0.1)；SOD酶活性測定結(jié)果顯示，毛蚶培養(yǎng)試驗處理組組內(nèi)與組間測定值無顯著差異(P>0.05)，紫貽貝僅在第16 d各處理組組間差異顯著(P<0.05)。對苯二酚對毛蚶、紫貽貝的ρ(NOEC)分別為0.40與0.60 mg/L。