固相萃取-超高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜法同時測定地表水中8種亞硝胺類化合物

張蓓蓓，趙永剛，孫慧婧，史震宇

(國家環(huán)境保護地表水環(huán)境有機污染物監(jiān)測分析重點實驗室，江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心， 江蘇 南京 210019)

N-亞硝胺類化合物(Nitroamines，NAms)作為新型的含氮消毒副產(chǎn)物，是一類潛在的人類致癌物，主要包括N-亞硝基二甲胺(NDMA)、N-亞硝基甲乙胺(NMEA)、N-亞硝基二乙胺(NDEA)、N-亞硝基二正丙胺(NDPA)、N-亞硝基二正丁胺(NDBA)、N-亞硝基嗎琳(NMOR)、N-亞硝基吡咯烷(NPYR)、N-亞硝基哌啶(NPIP)和N-亞硝基二苯胺(NDPhA)等9種。其中NDMA是NAms的典型代表，它是發(fā)現(xiàn)最早、檢出率最高、研究最為廣泛的一種亞硝胺類消毒副產(chǎn)物[1]。自1956年Magee[2]報道了亞硝胺類物質(zhì)具有致癌作用后，人們對其毒性及致癌作用進行了廣泛的研究。動物實驗表明，100種亞硝胺類化合物中75%以上能誘發(fā)癌癥[3]。亞硝胺具有非常強的基因毒性，誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生的部位主要集中在肝臟和食管，也可能引發(fā)膀胱、肺和腦部產(chǎn)生腫瘤[4-5]。

亞硝胺類物質(zhì)存在于大氣、土壤、水、化工產(chǎn)品、煙草、食品、藥物和農(nóng)藥等環(huán)境介質(zhì)中[6]，且分布廣泛。其來源主要有：工業(yè)生產(chǎn)過程中使用或產(chǎn)生的亞硝胺類物質(zhì)、飲用水消毒副產(chǎn)物、食品中廣泛存在的亞硝基類物質(zhì)及其前體物的轉(zhuǎn)化[7]。2010年，Wang等[8]檢測了中國12個水廠的原水及出廠水中的9種亞硝胺類飲用水消毒副產(chǎn)物(DBPs)的濃度水平，檢測出6種亞硝胺類物質(zhì)，分別為NDMA, NDEA, NDBA，NMOR, NDPhA和NMEA，其中NDMA, NDEA, NDBA和NMOR是最常檢出的亞硝胺類物質(zhì)。2015年，Ting等[9]對我國江蘇省8個城市9個飲用水廠中水源水、管網(wǎng)水及飲用水出水中的NAms進行了檢測，飲用水中9種NAms的總質(zhì)量濃度最高達765 ng/L，均值為42 ng/L，其中NDMA的濃度與華南地區(qū)報道的數(shù)據(jù)相近，在中國處于較高水平。董蕾等[10]研究了2015—2016年我國東北、東南、西南的6個地區(qū)性代表城市的原水、出廠水和管網(wǎng)水中含氮消毒副產(chǎn)物，結(jié)果表明，6個城市飲用水中NDMA、NDPA和NDEA質(zhì)量濃度>10 ng/L。

為了保障飲用水安全，確保人體健康，部分國家和地區(qū)對飲用水中亞硝胺的濃度水平做出了限制。2002年，美國加利福尼亞州的健康服務(wù)部制定的NDMA、NDEA和NDPA標(biāo)準(zhǔn)限值為10 ng/L。加拿大衛(wèi)生部規(guī)定飲用水中NDMA的質(zhì)量濃度不得>40 ng/L，安大略省環(huán)境部限定該省飲用水中NDMA的質(zhì)量濃度應(yīng)<9 ng/L。2004年，荷蘭限定飲用水中MDMA的質(zhì)量濃度不得>12 ng/L。2007年，德國衛(wèi)生部給出飲用水中NMOR和NDMA的限制值為10 ng/L。世界衛(wèi)生組織(WHO)于2008年規(guī)定NDMA的限制值為100 ng/L。2009年，美國馬薩諸塞州和澳大利亞建議飲用水中NDMA的限制值分別為10和100 ng/L。我國《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749—2006)及相關(guān)環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均未將亞硝胺類納入管控目標(biāo)。雖然我國已有《水質(zhì) 亞硝胺類化合物的測定 氣相色譜法》(HJ 809—2016)標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法僅測定水中4種亞硝胺類且檢出限僅在μg/L水平。因此，進一步優(yōu)化這類化合物的分析方法，提高方法的靈敏度和準(zhǔn)確性，才能夠滿足各類環(huán)境監(jiān)管的需求。

相較于氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜法[11-12]，近年來研究人員逐步采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)分析亞硝胺類化合物[13-14]，LC-MS/MS技術(shù)對高沸點、熱不穩(wěn)定、親水性亞硝胺類化合物的測定具有優(yōu)勢。9種常見的亞硝胺類化合物中，NDPhA由于分子量大、水溶性較差及熱不穩(wěn)定性等化學(xué)性質(zhì)，在水樣前處理過程及儀器分析過程中，與其他8種化合物均顯示出較大差異?；趤喯醢奉愒谖覈w中的污染狀況、國內(nèi)外環(huán)境監(jiān)管情況及化學(xué)性質(zhì)分類，最終選取了NDMA、NDEA、NMEA、NDPA、NDBA、NPYR、NMOR、NPIP 這8種目標(biāo)物，通過固相萃取(SPE)對地表水樣進行萃取富集，采用液相色譜-大氣壓化學(xué)電離源-三重四極桿質(zhì)譜法(UPLC-APCI-MS/MS)實現(xiàn)同時定性定量分析。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑

NDMA、NDEA、NMEA、NDPA、NDBA、NPYR、NMOR、NPIP共8種標(biāo)樣(5 000 mg/L，美國AccuStandard公司)；N-亞硝基二甲胺-D6(NDMA-D6)、N-亞硝基二丙基胺-D14(NDPA-D14)共2種內(nèi)標(biāo)物(100 mg/L，美國AccuStandard公司)；甲醇、二氯甲烷(色譜純，德國Merck公司)；超純水由Millipore純水機每日制備。

1.2 樣品制備

制備儀器：E 9000全自動固相萃取儀(日本GL公司)；椰殼活性炭固相萃取柱(2 g/6 mL， 德國CNW公司)；TurboVapII型全自動定量濃縮儀(瑞典Biotage公司)；0.22 μm聚偏二氟乙烯針頭過濾器(德國Merck公司)。

制備過程：量取1 000 mL水樣置于干凈的玻璃樣品瓶中，用椰殼活性炭固相萃取柱對水樣進行富集。小柱依次用10 mL二氯甲烷，10 mL甲醇以及10 mL超純水活化。之后，水樣以5 mL/min的流速進行上樣。水樣全部通過后，用10 mL超純水淋洗小柱。小柱在氮氣流和真空泵作用下進行除水，最后用15 mL二氯甲烷洗脫收集。洗脫液加入0.5 mL超純水后，經(jīng)氮氣吹至0.5 mL左右，用超純水定容至1.0 mL，加入10 μL 5.0 mg/L的內(nèi)標(biāo)使用液。將上述樣品經(jīng)0.22 μm針式濾頭過濾，轉(zhuǎn)移至2 mL樣品瓶中，在4 ℃下保存，并在7 d內(nèi)進行儀器分析。

1.3 分析儀器與條件

分析儀器：Aquity/AB SCIEX 6500超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；Analyst 1.6工作站；Atlantis T3色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm，美國 Waters公司)。

分析條件：流動相為超純水(A)和甲醇(B)，采用梯度洗脫模式，0～1 min，B相體積保持5%；1～3 min，B相體積由5%線性上升為30%；3～8 min，B相體積由30%線性上升為100%，并保持1 min；之后B相體積迅速降為5%并保持1 min。流量 0.45 mL/min，進樣量 10 μL，色譜柱溫為 30 ℃。內(nèi)標(biāo)法定量。

8種目標(biāo)物采用大氣壓力化學(xué)電離源(APCI)分析，正離子掃描方式，多反應(yīng)監(jiān)測。質(zhì)譜參數(shù)：氣簾氣壓力為2.07×105Pa，碰撞氣壓力為Medium，噴霧氣壓力為3.45×105Pa，電暈針電流1.0 μA，離子源加熱氣體溫度為250 ℃，離子化電壓為5 500 V。目標(biāo)物均采用多離子反應(yīng)監(jiān)測方式(MRM)，具體條件見表1。

表1 目標(biāo)物的多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)①

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

本實驗為了獲得最佳分離效果和較好的色譜峰形, 分別考察了甲醇-水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.005 mol/L醋酸銨水溶液作為流動相對目標(biāo)物分離的影響。結(jié)果表明，水相中添加劑的加入，對目標(biāo)物的峰形沒有影響，醋酸銨的加入會使部分目標(biāo)物的響應(yīng)降低。另外，在水相pH值為 2.00～8.00的甲酸銨水溶液和甲醇流動相中進行研究發(fā)現(xiàn)，NMEA出現(xiàn)了色譜雙峰的現(xiàn)象，無論pH值如何調(diào)整，雙峰均未得到改善(圖1)。經(jīng)研究和查閱文獻發(fā)現(xiàn)，8種目標(biāo)物中僅NMEA為非對稱性結(jié)構(gòu)，該目標(biāo)物存在手性對映異構(gòu)體，因此呈現(xiàn)了色譜雙峰的現(xiàn)象[15]。

圖1 NMEA色譜雙峰

考察了不同色譜柱對亞硝胺類化合物的保留行為。相比較于C18柱，T3柱對于強極性化合物如NDMA的色譜保留更強，更加有利于實際樣品中基質(zhì)和目標(biāo)物的分離。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

對質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的8種目標(biāo)物單個標(biāo)準(zhǔn)溶液在電噴霧離子源(ESI)+/-及大氣壓化學(xué)電離源(APCI)+/-的4種方式下進行一級質(zhì)譜母離子掃描。結(jié)果表明，在APCI正離子模式下8種目標(biāo)物有更好的響應(yīng)，基峰均為[M+H]+。優(yōu)化母離子錐孔電壓之后，選定[M+H]+為母離子，進行二級質(zhì)譜掃描，尋找子離子碎片，確定定量離子和定性離子及其最佳碰撞能量，以達到最佳的檢測靈敏度。

同時考察了不同離子源加熱溫度(250，350，550 ℃)和不同電暈針電流(1.0，3.0，5.0 μA)對各目標(biāo)物色譜響應(yīng)的影響，結(jié)果表明，離子源加熱溫度為250 ℃時各目標(biāo)物的響應(yīng)最高，隨著溫度的上升，目標(biāo)物響應(yīng)下降明顯。電暈針電流在1.0，3.0，5.0 μA時各目標(biāo)物的響應(yīng)變化不明顯，故最終選取1.0 μA電流、250 ℃離子源加熱溫度作為方法條件。

2.3 固相萃取條件選擇

Planas等[16]對比了椰殼活性炭和琥珀活性炭 572(Ambersorb 572)對目標(biāo)化合物的富集效果。實驗結(jié)果表明，采用椰殼活性炭萃取，絕大多數(shù)亞硝胺類目標(biāo)化合物的回收率(73%～91%)均較高。Ambersorb 572的萃取效果低于椰殼活性炭，尤其針對NDMA，回收率僅為43%，是椰殼活性炭回收率(88%)的一半。參照文獻[16]，本實驗采用椰殼活性炭固相萃取小柱進行富集?？瞻姿畼又懈髂繕?biāo)物的加標(biāo)質(zhì)量濃度為50 ng/L，平均回收率見圖2。由圖2可見，采用椰殼活性炭固相萃取柱進行萃取，8種目標(biāo)物的回收率為62.1%～86.3%。

圖2 固相萃取法對8種目標(biāo)物的空白水樣加標(biāo)回收率(n=6)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用超純水配制質(zhì)量濃度依次為5，10，20，50，80和100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列1.0 mL，置于進樣瓶中，各加入10 μL 5 mg/L的內(nèi)標(biāo)使用液，混勻。以待測物與內(nèi)標(biāo)物定量離子的峰面積比(Y)對待測物的質(zhì)量濃度(X，μg/L)進行線性回歸，得到線性方程。8種目標(biāo)物在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)均>0.995 0，8種目標(biāo)物多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖3。

圖3 8種目標(biāo)物色譜圖(ρ=100 μg/L)

2.5 檢出限

根據(jù)《環(huán)境監(jiān)測 分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168—2010)方法檢出限測定要求，配制質(zhì)量濃度為5.0 ng/L的空白水加標(biāo)樣7份，按照樣品分析過程進行測定，計算7次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差(S)，以3S為檢出限(LOD)，4倍檢出限為定量下限(LOQ)，結(jié)果見表2。8種目標(biāo)物的檢出限為1.1～1.8 ng/L，方法靈敏度高，完全能夠滿足地表水中該類痕量污染物檢測要求。

表2 水中目標(biāo)物的方法檢出限及定量下限(n=7) ng/L

2.6 精密度及準(zhǔn)確度

配制低(10.0 ng/L)、中(40.0 ng/L)、高(80.0 ng/L)3個質(zhì)量濃度水平的地表水加標(biāo)樣各6份，按上述優(yōu)化的實驗條件，進行準(zhǔn)確度和精密度實驗。選取的地表水樣品在加標(biāo)前經(jīng)測定，8種目標(biāo)物均未檢出。每個添加濃度測定6份樣品，計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，8種目標(biāo)物的回收率為55.4%～90.4%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～14.3%。方法準(zhǔn)確度和精密度均符合痕量分析的要求。

表3 地表水中8種目標(biāo)物的精密度和準(zhǔn)確度(n=6)

2.7 實際地表水樣品分析

用該方法對江蘇省鹽城市、泰州市和南通市3個地區(qū)的部分地表水開展了監(jiān)測。結(jié)果表明，鹽城市部分地表水中檢出較高質(zhì)量濃度的NDMA，2個點位的地表水樣品中檢出濃度分別為298和30.7 ng/L，推測在鹽城地表水測定點位上游存在相關(guān)的工業(yè)源排放。其他地區(qū)所有目標(biāo)物均未檢出。

3 結(jié)語

建立了固相萃取(SPE)-超高效液相色譜/三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)同時測定地表水中8種亞硝胺的方法，該方法可實現(xiàn)8種亞硝胺類化合物的同時測定，方法具備準(zhǔn)確度高、靈敏度高的優(yōu)勢。經(jīng)實際樣品的測定表明，該方法具有較好的適用性，抗干擾能力強，完全能夠滿足地表水樣品的快速監(jiān)測要求，亦適用于各類環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的評價要求。