魚類樣品中有機(jī)磷阻燃劑分析方法的優(yōu)化研究

侯瑞，李逸，梁永津，趙彥龍，王旭濤

(生態(tài)環(huán)境部珠江流域南海海域生態(tài)環(huán)境監(jiān)督管理局生態(tài)環(huán)境監(jiān)測與科學(xué)研究中心，廣東 廣州 510610)

近年來，隨著溴系阻燃劑(brominated flame retardants，BFRs)在全球范圍內(nèi)的限制使用，有機(jī)磷阻燃劑(organophosphate flame retardants，OPFRs)作為其優(yōu)秀替代品，生產(chǎn)量和使用量正快速增長[1]。OPFRs兼具增塑劑等功能，廣泛應(yīng)用在塑料、潤滑劑、橡膠制品、電子設(shè)備、紡織品、家具和食品包裝等工業(yè)品中。中國已成為OPFRs生產(chǎn)和使用大國，并以年均15%的速率增長[2]，因此越來越多的研究開始關(guān)注OPFRs的環(huán)境行為、生物富集和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

由于OPFRs主要是以添加(非化學(xué)鍵合)的形式存在于產(chǎn)品中，生產(chǎn)、使用和廢棄過程會向周圍環(huán)境釋放，使其廣泛分布于灰塵、室內(nèi)空氣、大氣、地表水、沉積物和土壤等各種環(huán)境介質(zhì)中[1-2]。我國太湖[3]、環(huán)渤海地區(qū)[4]和臺灣地區(qū)[5]的地表水和沉積物中有大量OPFRs被檢出。在世界各地，幾乎所有生產(chǎn)的OPFRs都在海洋和淡水魚類、禽類、昆蟲和人類樣品中檢出[6]。其中，ΣOPFRs在瑞典的淡水魚中富集水平可高達(dá)1 000 ng/g(以脂重計(jì))，而在西班牙的河流淡水魚中發(fā)現(xiàn)高達(dá)2 423 ng/g 的ΣOPFRs[7-8]。毒理學(xué)研究表明，所有OPFRs均具有不同強(qiáng)度的神經(jīng)毒性和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[1-2]。由于OPFRs在各環(huán)境介質(zhì)中大量分布，須對其在生物體內(nèi)的富集情況和潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行研究。

不同結(jié)構(gòu)的有機(jī)磷酸酯具有不同的物理化學(xué)性質(zhì)和生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。OPFRs是磷酸酯類衍生物，根據(jù)酯基結(jié)構(gòu)的不同，大致可分為3類：氯代(Cl-/Chlorinated OPFRs)、烷基取代(alkyl-OPFRs)和芳香基取代(aryl-OPFRs)有機(jī)磷酸酯。不同結(jié)構(gòu)的OPFRs具有不同的物理化學(xué)特性。其中，芳香基取代OPFRs具有較高的正辛醇/水分配系數(shù)(LogKOW值)，而氯代OPFRs比其他取代基的OPFRs更易溶于水[1,9]。不同OPFRs的結(jié)構(gòu)和極性的差異使其很難進(jìn)行同步分析。目前，國內(nèi)關(guān)于OPFRs檢測方法的研究主要針對環(huán)境樣品，包括地表水[10]、飲用水[11]、沉積物[12]、活性污泥[13]、灰塵[12]等。關(guān)于生物樣品中OPFRs的檢測方法和相關(guān)生物富集狀況的研究相對較少，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化分析方法。因此，建立生物樣品中OPFRs快速、同步、有效的分析測定方法具有重要意義。

建立了9種OPFRs在魚類組織中的固相萃取超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(SPE-UPLC-MS/MS)分析方法。通過優(yōu)化前處理?xiàng)l件、液相色譜和質(zhì)譜檢測條件，該方法可以最大限度地減少生物組織復(fù)雜基質(zhì)的干擾，具有消耗溶劑少、精密度高、檢出限低、準(zhǔn)確度好、可對不同結(jié)構(gòu)OPFRs同步分析等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對魚類樣品中OPFRs的分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Waters ACQUITY超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，配置ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm，美國沃特世公司)；戴安ASE 350加速溶劑萃取儀(美國賽默飛世爾公司)；IKA-A11分析研磨機(jī)(德國IKA公司)；LGJ-18冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；HN 1006超聲波清洗儀 (中國華南超聲設(shè)備廠)；Supelco固相萃取裝置(美國 Supelco公司)。

1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

9種OPFRs標(biāo)準(zhǔn)品包括：磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)、磷酸三(2-氯丙基)酯(TCIPP)、磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯(TDCPP)、磷酸三苯酯(TPHP)、磷酸三丁酯(TNBP)、磷酸三(丁氧基乙基)酯(TBOEP)、磷酸三(甲苯酯)(TCP)、2-乙基己基二苯基磷酸酯(EHDPHP)、磷酸三(2-乙基己基)酯(TEHP)，均購于Accustandard公司(美國)，純度均>99%。內(nèi)標(biāo)物TDCIPP-d15(純度為99%)，購于Toronto Research Chemicals公司(加拿大)。所有有機(jī)溶劑均為HPLC級。硅藻土為ASE 350加速溶劑萃取儀專用，均購于賽默飛世爾公司(美國)。用水均為超純水(美國Millipore公司)。

其他實(shí)驗(yàn)設(shè)備包括：0.22 μm玻璃纖維濾膜及抽濾裝置(美國Millipore公司)；GHP針頭過濾器(13 mm×0.2 μm，美國Pall公司)。

1.3 萃取和凈化條件

利用鯽魚肌肉組織進(jìn)行前處理。鯽魚購自廣州某大型超市，長約(20±6) cm，質(zhì)量(212±15) g。取新鮮鯽魚，獲取魚體腹部和背部肌肉(去皮)，切成小塊后，用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥96 h(-50 °C)，計(jì)算肌肉樣品的含水量，樣品保存于-50 °C。然后將冷凍干燥的肌肉樣品用分析研磨機(jī)粉碎，粉碎混合均一化后，稱取魚肉干粉200 mg，加入硅藻土(質(zhì)量比為1∶1)，轉(zhuǎn)入ASE萃取池，加入回收率指示物標(biāo)液(TDCIPP-d15，20 ng)。于100 ℃、10.3 MPa下，由ASE加速萃取，萃取溶液為正己烷(HEX)/二氯甲烷(DCM)混合溶液(V/V=1∶1)，循環(huán)3次。將5 g無水硫酸鈉加入萃取液接收瓶中，以除去多余的水分；取體積分?jǐn)?shù)為10%的萃取液樣品進(jìn)行粗脂肪含量測定，測定方法參照《食品中脂肪的測定》(GB/T 5009.6—2003)，蒸去溶劑后稱重得出。

剩余萃取液用Bond Elut NH2固相萃取柱(1 g/6 mL，美國安捷倫公司)進(jìn)行富集和凈化。優(yōu)化了上樣溶液和淋洗液中二氯甲烷和正己烷的體積比。將ASE萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5 mL后，配置為不同溶劑比例的上樣溶液，并選擇適合的溶劑進(jìn)行洗脫。淋洗液經(jīng)氮吹置換溶劑為甲醇，加入內(nèi)標(biāo)化合物并定容至1 mL，過0.2 μm GHP膜后，置于棕瓶-20 ℃保存，待測。同時，制備實(shí)驗(yàn)室空白樣品(LRB)、加標(biāo)樣品(LFB)各6個。實(shí)驗(yàn)室空白樣品用200 mg硅藻土代替魚肉干粉，加標(biāo)樣品由200 mg魚肉干粉加20 μg OPFRs混合標(biāo)液混勻制成。

1.4 液相色譜質(zhì)譜條件

超高效液相色譜(UPLC)條件：Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm×1.7 μm)，柱溫40 ℃。流動相為1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)(V/V)，流量為0.3 mL/min。流動相梯度為：0 min，40% B；1～4 min,65% B；5.5 min，85% B；8～12 min，95% B；12.1 min，40% B。

串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)條件：采用電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描下，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，對錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化(表1)。 優(yōu)化質(zhì)譜條件后，峰寬分辨率0.7m/z，噴霧電壓4 500 V，毛細(xì)管溫度300 ℃，碰撞氣壓0.199 Pa(Ar)。

表1 OPFRs的離子轉(zhuǎn)換、質(zhì)譜條件、保留時間和儀器檢出限①

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

在以往的研究中，往往通過固相吸附法凈化去除魚類樣品中共萃取的脂質(zhì)、可溶性鹽、氨基酸等物質(zhì)基質(zhì)干擾，是一種快速、簡單且節(jié)省溶劑的凈化手段。常用的固相吸附劑為氧化鋁、多種官能團(tuán)鍵合的硅膠、硅酸鎂載體及高分子樹脂等材料[14]。其中，氨基鍵合硅膠的固相萃取柱在對生物樣品(鳥類卵)的OPFRs前處理凈化中已有一定應(yīng)用[15]。氨基和OPFRs的磷酸酯基團(tuán)具有極性作用力，可以在非極性溶劑中避免吸附脂質(zhì)的前提下對OPFRs進(jìn)行吸附，并利用偏極性溶劑對吸附的OPFRs進(jìn)行洗脫，從而達(dá)到凈化效果。因此，選取了氨基柱(Bond Elut NH2)為萃取柱，對固相萃取過程上樣、淋洗和洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，使其同時對魚類樣品中不同極性的OPFRs達(dá)到較好的凈化效果。上樣液、淋洗液、洗脫液及加速萃取溶劑對9種OPFRs的影響見圖1(a)(b)(c)(d)。

首先，考察了不同極性固相萃取上樣溶液對9種OPFRs回收率的影響，見圖1(a)。將OPFRs配置于1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、1∶0(V/V)的5組正己烷/二氯甲烷溶液中，分別通過氨基柱，測定OPFRs的回收率。同時，將花生油配置于各上樣溶液中，以測定粗脂肪的去除效果。結(jié)果顯示，隨著上樣溶液極性的降低，各OPFRs的回收率逐漸提高，且體積比>4∶1 的正己烷/二氯甲烷溶液可使大多數(shù)OPFRs富集于固相萃取柱中。然而，隨著上樣溶液極性的降低，粗脂肪的去除率逐漸升高，純正己烷作為上樣溶液時，只有61.9 %的脂肪去除率，見圖1(a)。其次，優(yōu)化了淋洗液中二氯甲烷和正己烷的混合比例。配置不同比例的二氯甲烷和正己烷淋洗液(體積比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1)，經(jīng)氨基柱活化、上樣等步驟后，分別使用不同極性的淋洗液進(jìn)行淋洗，考察各OPFRs在不同淋洗液中的分布情況，見圖1(b)。與上樣溶液優(yōu)化的結(jié)果接近，4∶1(V/V)的正己烷/二氯甲烷中沒有OPFRs的檢出。因此，為尋求脂肪去除和OPFRs保留的平衡，使用4∶1(V/V)的正己烷/二氯甲烷溶液作為氨基固相萃取柱的上樣溶液，即由1∶1(V/V)的正己烷/二氯甲烷加速萃取生物樣品后，將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL后，加入20 mL 4∶1(V/V)的正己烷/二氯甲烷，混勻上樣。經(jīng)這一過程，可去除魚類樣品中約78.3%的粗脂肪。

圖1 上樣液、淋洗液、洗脫液及加速萃取溶劑對9種OPFRs的影響

另外，考察了不同洗脫溶液對9種OPFRs回收率的影響。設(shè)置了5種不同極性的洗脫液：1∶1(V/V)的正己烷/二氯甲烷、1∶2(V/V)的正己烷/二氯甲烷、二氯甲烷、9∶1(V/V)的二氯甲烷/甲醇(Methanol)、3∶1 (V/V)的二氯甲烷/甲醇。重新用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)過氨基柱凈化后，依次用4 mL上述溶液洗脫，并測定洗脫液中的OPFRs含量，結(jié)果見圖1(c)。結(jié)果顯示，第一、第五部分的洗脫液中均無OPFRs被檢出，而1∶1(V/V)的正己烷/二氯甲烷、二氯甲烷中各有較高比例的OPFRs被檢出，9∶1(V/V)的二氯甲烷/甲醇也有少量的TCEP被檢出。所以，設(shè)置的氨基柱的洗脫溶液依次為：4 mL 1∶1 (V/V)的正己烷/二氯甲烷、8 mL的二氯甲烷和4 mL 9∶1(V/V)的二氯甲烷/甲醇。

最后，探討了不同溶液對魚類樣品中OPFRs的萃取效率的影響。對于非極性化合物的加速溶劑萃取法常用的溶劑為正己烷、二氯甲烷和丙酮(Acetone)的1∶1 (V/V)組合。所以對兩兩組合3種加速溶劑萃取條件下各OPFRs的回收率進(jìn)行測定，即1∶1 (V/V)的正己烷/二氯甲烷、1∶1 (V/V)的正己烷/丙酮和1∶1(V/V)的二氯甲烷和丙酮，結(jié)果如圖1(d)所示。3種加速溶劑萃取條件下，1∶1(V/V)的正己烷/二氯甲烷和1∶1(V/V)的正己烷/丙酮萃取液的萃取效率均相對較高?？紤]后續(xù)上樣溶液為正己烷和二氯甲烷的混合，需要保持較高的非極性，所以選擇了1∶1(V/V)的正己烷/二氯甲烷作為加速萃取溶劑。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 色譜和質(zhì)譜條件

分別將10 μg/mL的各OPFRs單標(biāo)準(zhǔn)溶液通過質(zhì)譜直接進(jìn)樣，用于三重四極桿質(zhì)譜MRM掃描條件的優(yōu)化。9種OPFRs均可采用ESI+模式電離；選擇各分子離子[M+H]+作為母離子，對其二級質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。通過優(yōu)化，可以保證MRM模式下被測離子對在質(zhì)譜中具備較高的響應(yīng)度。表1顯示了9種OPFRs優(yōu)化后的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞電壓等重要的質(zhì)譜參數(shù)。經(jīng)過梯度洗脫條件的優(yōu)化，各OPFRs可以在BEH C18色譜柱中得到完全分離，13 min內(nèi)可完成檢測。9種OPFRs在標(biāo)準(zhǔn)溶液中的總離子流圖見圖2。

圖2 UPLC-MS-MS檢測9種OPFRs的總離子流色譜圖

2.2.2 線性關(guān)系、檢出限和精密度

通過甲醇稀釋OPFRs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配置標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線在1～2 000 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2≥ 0.995。

按照優(yōu)化條件，用硅藻土代替組織樣品，以檢測樣品提取、純化、儀器分析過程中目標(biāo)化合物的干擾(n=7)，并確定該方法的檢出限與測定下限。由于空白樣品中均有各OPFRs的檢出，計(jì)算7次平行空白測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，根據(jù)《環(huán)境監(jiān)測 分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168—2010)附錄A中的t值，以3.143倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差確定方法檢出限，并以4倍檢出限作為測定下限。根據(jù)結(jié)果，按鯽魚肌肉樣品的平均脂含量計(jì)(2.9 ± 0.1)%，本方法的檢出限(MLD)和測定下限(MLQ)范圍分別為0.004～0.026和0.016～0.104 ng/g(以脂重計(jì))(表2)。本方法的檢出限低于或接近于常用的分散固相萃取串聯(lián)氣相色譜技術(shù)[16-17](MLD為0.01～9 ng/g，以脂重計(jì))和堿性氧化鋁濾芯的固相提取串聯(lián)液相色譜技術(shù)[18](MLD為0.35～6.37 ng/g，以脂重計(jì))測定得到的檢出限。

質(zhì)量控制樣品(質(zhì)量濃度為10 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，n=6)在每批樣品中都有運(yùn)行，以確保分析的穩(wěn)定性(即日間RSD %)(表2)。OPFRs的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.6%～5.9 %。結(jié)果說明，該方法具有較低的檢出限和較高的精密度。

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng)和回收率

基質(zhì)效應(yīng)和回收率實(shí)驗(yàn)通過鯽魚肌肉組織樣品加標(biāo)進(jìn)行測定。基質(zhì)效應(yīng)按照萃取后添加待測成分的方法進(jìn)行測試，取魚肉樣品萃取、凈化后的待測液(濃度為B)，加入100 ng/g(干重)各OPFRs標(biāo)液(濃度為A)，按照公式Matrix effect =(A-B)/B×100%計(jì)算而得[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除TPHP外，分析過程中OPFRs的回收率為77.2% ～108%?？傮w上，大多數(shù)目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)<42.1%，特別是極性較強(qiáng)的TBOEP、TNBP、TCEP、TDCIPP和TCIPP，基質(zhì)效應(yīng)均<30%(表2)；而Log KOW值更高的EHDPHP(6.30)和TEHP(9.49)的基質(zhì)效應(yīng)反而比Log KOW值稍小的TPHP(4.70)和TCP(5.48)更低。魚肉樣品中OPFRs基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生是生物基質(zhì)中內(nèi)源性的物質(zhì)與待測物的色譜共流出導(dǎo)致的；利用氨基柱的極性吸附力，可以去除大部分糖脂和類固醇等非極性的類脂物質(zhì)，而磷脂類物質(zhì)與OPFRs的結(jié)構(gòu)類似，也具有一定的極性吸附力，可能會導(dǎo)致TPHP和TCP較高的基質(zhì)效應(yīng)。但總體來說，通過氨基柱的凈化作用，大大降低了有機(jī)磷阻燃劑與魚類樣品中生物基質(zhì)共洗脫的可能性。

表2 魚類樣品OPFRs分析方法的方法檢出限、方法測定下限、平均基質(zhì)效應(yīng)、回收率、RSD及線性范圍①

2.3 魚類樣品測定

采用本方法檢測了廣州市場中鯽魚和北京市野生鯽魚的肌肉中OPFRs的含量，結(jié)果見圖3。在2批鯽魚樣品中，9種OPFRs均有檢出，質(zhì)量比> 0.93 ng/g(以脂重計(jì))，說明OPFRs在這2個地區(qū)使用廣泛并已分布于當(dāng)?shù)氐乃h(huán)境中。鯽魚肌肉中主要的OPFRs為TNBP、TEHP、TCIPP和TCEP，其質(zhì)量比為5.94～33.7 ng/g(以脂重計(jì))；總OPFRs含量與文獻(xiàn)報(bào)道接近[20-21]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，北京市野生鯽魚肌肉中總OPFRs含量略高于廣州市養(yǎng)殖鯽魚，但無明顯差異(P>0.05)。污水處理廠再生水為北京市河流的重要供水來源，且OPFRs在污水處理廠中處理效率有限，會導(dǎo)致北京市河流魚類具有較高的OPFRs暴露[20]。魚類富集OPFRs的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)需要更多數(shù)據(jù)來證實(shí)。

圖3 鯽魚肌肉樣品中OPFRs的質(zhì)量比及分布情況(n=5)

3 結(jié)語

通過優(yōu)化萃取、凈化和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件，建立了一種氨基柱凈化魚類樣品測定9種OPFRs的方法。該方法步驟簡單、消耗溶劑少、凈化效率高、檢出限低、準(zhǔn)確度高，可以實(shí)現(xiàn)對魚類組織中多種有機(jī)磷阻燃劑的監(jiān)測調(diào)查，可為深入研究該類污染物的生物富集、生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和健康評估提供強(qiáng)有力的方法參考。