利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚探究四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)的神經(jīng)毒性作用

顧杰，郭敏，吉貴祥，石利利

(生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210042)

多溴聯(lián)苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)是一類溴化阻燃化學(xué)品，因其價格低廉和具有良好的阻燃作用，已被廣泛應(yīng)用于紡織、電子、塑料和家具等以聚合物為基礎(chǔ)的消費品生產(chǎn)中[1]。由于PBDEs不以化學(xué)鍵與聚合物結(jié)合，因此容易從添加到的聚合物中析出從而釋放進入環(huán)境。目前，PBDEs在大部分的環(huán)境介質(zhì)(例如沉積物、大氣、地表水和海洋環(huán)境)中被廣泛檢出[2-3]。在209種PBDEs中，2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)是在人類血液和牛奶中檢出濃度最高的一種同系物，約占人體 PBDEs總暴露量的50%[4]。

隨著BDE-47大規(guī)模的生產(chǎn)和使用，導(dǎo)致其大量釋放進入環(huán)境中，對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成了嚴(yán)重威脅。由于PBDEs水溶性較低，水體中大部分PBDEs以懸浮顆粒物結(jié)合形式存在。已有的研究表明，自然水體中 PBDEs含量一般不高，多為未檢出到幾百pg / L[5-7]，污水處理廠出水中的質(zhì)量濃度較高。Wang等[8]對巢湖7條入湖河流中PBDEs的污染情況進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)∑8PBDEs的質(zhì)量濃度范圍為0.31～84 ng/L，其中BDE-47、五溴聯(lián)苯醚(BDE-99)和2,2′,4,4′,5,5′-六溴聯(lián)苯醚(BDE-153)的質(zhì)量濃度分別為0.012～0.36、0.012～1.3和0.012～0.77 ng/L。四川錦江河BDE-47在水體、底泥、魚肉、魚鰓、內(nèi)臟的平均值分別為0.25 ng/L、0.29 ng/g (干重)、15.7 ng/g(脂肪)、9.32 ng/g(脂肪)、15.8 ng/g(脂肪)[9]。

PBDEs可以通過食物的攝取、呼吸等途徑進入人體。研究發(fā)現(xiàn)，華南地區(qū)孕婦胎盤、母乳、胎兒臍血和新生兒尿液中的∑17PBDEs質(zhì)量比分別為(15.8±9.88) ng/g(脂肪)、(13.2±7.64) ng/g(脂肪)、(16.5±19.5) ng/g(脂肪)和(0.001 80±0.001 99) ng/L，BDE-47是所有樣本中最主要的同系物種類，約占∑17PBDE的24.7%～56.8%[10]。值得注意的是，電子垃圾回收站和阻燃劑生產(chǎn)區(qū)居民血清中PBDEs水平較高。研究表明，電子廢棄物回收工人和電子廢棄物拆解工人血清中∑PBDEs的質(zhì)量比分別為105～4 099 ng/g(脂肪)(BDE-28、-47、-66、-99、-100、-153、-154、-183、-209)和5.58～228.52 ng/g(脂肪)(BDE-196、-197、-203、-206、-207、-208、-209)[11]。

BDE-47具有內(nèi)分泌干擾毒性、神經(jīng)毒性、肝臟毒性、生殖毒性及免疫毒性等[12-15]。目前的研究熱點主要集中于BDE-47的發(fā)育毒性、生殖毒性和神經(jīng)毒性方面。動物實驗研究表明，雌性小鼠在孕期暴露BDE-47可造成子代發(fā)育遲緩，行為改變[16-17]。BDE-47及其衍生物暴露能夠誘導(dǎo)嚙齒類發(fā)育神經(jīng)毒性，引起大腦結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終導(dǎo)致行為異常[18]。然而，目前關(guān)于BDE-47的神經(jīng)毒性研究仍處于起步階段，相關(guān)的研究多集中于認(rèn)知功能、行為改變、學(xué)習(xí)與記憶等毒性表征方面。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚成魚連續(xù)暴露于0.5 mg/L的BDE-47，可導(dǎo)致斑馬魚空間學(xué)習(xí)和記憶能力下降，并與暴露天數(shù)的增加有時間效應(yīng)關(guān)系[19]。 同時， Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/L的BDE-47引起斑馬魚幼魚社交行為改變，社會活動接觸數(shù)和每次接觸時間顯著增加。然而，目前關(guān)于BDE-47的神經(jīng)毒性作用機制尚缺乏系統(tǒng)研究。吉貴祥等[21]研究發(fā)現(xiàn)，BDE-47可以影響斑馬魚體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，BDE-47通過產(chǎn)生氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡從而對斑馬魚造成神經(jīng)毒性作用，而異甘草素(isiquiritigenin，ISL)和乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-cysteine，NAC)作為典型抗氧化劑可以緩解BDE-47的神經(jīng)毒性作用。然而，關(guān)于BDE-47是否可能通過干擾神經(jīng)發(fā)育從而誘導(dǎo)行為缺陷還有待證實。

近年來，轉(zhuǎn)基因斑馬魚作為脊椎動物模型在神經(jīng)發(fā)育毒性研究中得到越來越廣泛的應(yīng)用[22-23]。與嚙齒動物模型相比，斑馬魚在研究神經(jīng)發(fā)育毒性方面的優(yōu)勢包括：(1)胚胎在母體體外發(fā)育，消除了母體毒性作為混雜因素的影響；(2)斑馬魚在早期發(fā)育階段是透明的，可使用顯微技術(shù)直接拍攝神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育情況；(3)斑馬魚體積小，胚胎發(fā)育快，生命周期短。elavl3基因別名huc，最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)，該基因缺失會導(dǎo)致視覺神經(jīng)系統(tǒng)缺陷伴隨神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不良，嚴(yán)重致死。elavl3在斑馬魚早期神經(jīng)發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的作用，是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要標(biāo)記基因[24-25]。利用基因修飾技術(shù)，在elavl3的啟動子區(qū)接入綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)基因，培育的Tg(elavl3:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚可以在全身神經(jīng)元中特異表現(xiàn)出綠色熒光，利用熒光顯微鏡可以直觀地觀察化學(xué)物質(zhì)對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響。

現(xiàn)通過BDE-47不同處理組斑馬魚幼魚行為軌跡來快速篩選BDE-47是否具有神經(jīng)毒性。同時，使用轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎Tg(elavl3:EGFP)作為模式生物，通過測定神經(jīng)細(xì)胞的熒光強度來量化BDE-47暴露后中樞神經(jīng)細(xì)胞的表達(dá)量，從而觀察斑馬魚中樞神經(jīng)的發(fā)育情況。最后進行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實驗，探究神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因是否發(fā)生改變，進一步評估BDE-47對斑馬魚的神經(jīng)發(fā)育毒性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：MS105DU電子分析天平(德國METTLER TOLEDO公司)；HQ40d水質(zhì)參數(shù)儀(美國哈希公司)；MGC-400B恒溫光照培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；ABI-7300熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；斑馬魚行為軌跡分析儀(荷蘭Noldus公司)；LSM510激光共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)。

試劑： BDE-47購自美國 Chemservice 公司；二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國QiaGen公司；TRIzol? 試劑購自美國賽默飛世爾公司；三氯甲烷和異丙醇購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 種魚飼養(yǎng)和胚胎收集

研究使用的斑馬魚品系為AB野生型和Tg(elavl3:EGFP)，種魚均購自中國科學(xué)院水生生物研究所(武漢)。在流水式循環(huán)飼養(yǎng)系統(tǒng)(ESEN-AW-SS-G-A，北京愛生)飼養(yǎng)種魚，水溫控制在(27±0.5)℃，光照周期為14 h光照/10 h暗光。種魚每天投喂剛孵化的豐年蟲2次，并及時清除多余的飼料和排泄物。在繁殖的前一天，雄魚和雌魚以1∶1的比例放入繁殖盒中，用隔板將繁殖盒中的親魚雌雄分開。次日清晨，將繁殖盒中的隔板拆掉，在光照的刺激下，雄魚開始追逐雌魚，雌魚開始產(chǎn)卵，收集所產(chǎn)受精卵。在顯微鏡下挑選正常發(fā)育的受精卵用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)沖洗3次，用于暴露實驗。

1.3 胚胎和幼魚毒性試驗

參考Chen等[26]和Wang等[14]的研究，選擇1，5和10 μmol/L 不同濃度的BDE-47暴露組進行暴露。BDE-47使用DMSO配制成母液，-20℃保存，溶液配制采用貯備液逐級梯度稀釋，使溶液中DMSO含量<1/10 000。胚胎收取后培養(yǎng)至受精后4 h(4 hours post fertilization，4 hpf)，挑選發(fā)育正常的斑馬魚胚胎進行不同處理組暴露，隨機分組分別暴露于0(對照)，1，5和10 μmol/L的BDE-47處理液中。每個劑量組中放置魚卵50 粒，每個劑量組設(shè)置3個平行，間隔12 h 更換胚胎處理液以保證暴露組濃度，期間觀察斑馬魚胚胎發(fā)育生長的過程，挑出死亡的胚胎。

1.4 斑馬魚運動行為測試

根據(jù)Nery等[27]的實驗方法，每個濃度組隨機選擇24條受精后6 d(6 days post fertilization，6 dpf)的斑馬魚幼魚放入24孔板，選擇健康能夠正常游動的斑馬魚幼魚，在24孔板中加入2 mL的曝氣水，每個孔中1條斑馬魚幼魚，隨后輕柔安置于斑馬魚行為分析儀中進行運動行為學(xué)測試，主要測試幼魚的自由游泳行為和在光周期下的游泳行為。受試魚在實驗之前進行10 min的環(huán)境適應(yīng)，實驗后剔除不正常幼魚的行為數(shù)據(jù)(不正常的數(shù)據(jù)主要有儀器檢測出現(xiàn)極值，相應(yīng)刪除數(shù)據(jù)或者進行多次重復(fù)實驗)。使用EthoVision軟件(荷蘭Noldus公司)分別采集40 min內(nèi)各組幼魚的運動軌跡，利用軟件導(dǎo)出運動行為距離、游行時間和游動的行為軌跡，然后計算每組魚游行的平均速度和平均距離，各數(shù)值分別納入統(tǒng)計。

1.5 轉(zhuǎn)基因斑馬魚圖像觀察

Tg(elavl3:EGFP)斑馬魚胚胎暴露于0，1，5和10 μmol/L BDE-47水溶液中，每個濃度組選擇10條斑馬魚幼魚(72 hpf)，采用4%的多聚甲醛固定30 min，采用體視熒光顯微鏡(SMZ18，日本尼康)拍攝綠色熒光標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞并記錄圖像，使用Image J軟件定量分析斑馬魚中樞神經(jīng)發(fā)育的變化。

1.6 熒光定量PCR

采用熒光定量PCR測定方法，利用Primer Premier軟件設(shè)計并合成神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因包括elav13基因和mbp基因以及內(nèi)參照基因(β-actin)的Real-time PCR引物，基因的引物序列見表1。每個濃度組收集6 dpf期的幼魚各20條，提取幼魚總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進行Real-time PCR實驗，檢測BDE-47暴露對斑馬魚神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響。

表1 基因引物序列

1.7 統(tǒng)計分析

所有實驗至少重復(fù)3次。采用單因素方差分析或配對t檢驗，所有統(tǒng)計分析，使用SAS統(tǒng)計分析系統(tǒng)(version 9.13, SAS Institute, Cary, NC)進行，設(shè)P<0.05時有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 BDE-47對斑馬魚幼魚運動行為的影響

對暴露于BDE-47(0, 1, 5和10 μmol/L)6 dpf的斑馬魚幼魚進行行為學(xué)測試，在連續(xù)暴露BDE-47 6 d之后，空白對照組孵化率>80%，孵化后存活率>90%，本次實驗有效。行為分析學(xué)研究如圖1(a)(b)所示，除1 μmol/L 低劑量處理組，其余處理組6 dpf斑馬魚幼魚運動行為速度顯著下降，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。圖1(b)顯示，隨著BDE-47濃度的增加，斑馬魚幼魚游動軌跡呈劑量依賴性降低。

圖1 BDE-47暴露對斑馬魚幼魚(6 dpf)運動行為的影響

2.2 BDE-47對斑馬魚幼魚神經(jīng)發(fā)育的影響

Tg(elavl3:EGFP)斑馬魚幼魚暴露于BDE-47(0, 1, 5和10 μmol/L)至72 dpf(72 dpf后斑馬魚幼魚熒光逐漸減弱)，中樞神經(jīng)熒光如圖2(a)(b)(c)(d)所示，Tg(elavl3:EGFP)斑馬魚幼魚頭部綠色熒光標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞熒光強度隨BDE-47的濃度增加而呈劑量依賴性降低。熒光定量分析結(jié)果如圖3所示，5和10 μmol/L BDE-47處理組顯著抑制斑馬魚幼魚的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

圖2 不同暴露組轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚中樞神經(jīng)熒光圖

圖3 BDE-47暴露對6 dpf轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚中樞神經(jīng)熒光定量

2.3 BDE-47對斑馬魚幼魚早期神經(jīng)發(fā)育基因的影響

對6 dpf的斑馬魚幼魚體內(nèi)神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因(elavl3和mbp)的表達(dá)情況進行檢測，結(jié)果見圖4(a)(b)，中高劑量組(5和10 μmol/L)與對照組相比，elavl3基因水平明顯下調(diào)；mbp基因在10 μmol/L 暴露濃度下，基因表達(dá)量明顯下調(diào)，說明BDE-47暴露抑制斑馬魚幼魚的早期神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。

圖4 BDE-47暴露對斑馬魚幼魚(6 dpf)神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的影響

3 討論

目前，體外和體內(nèi)試驗已經(jīng)廣泛證實了BDE-47的發(fā)育神經(jīng)毒性。例如，Liu等[28]利用大型蚤和大型金線蟲為模型，發(fā)現(xiàn)BDE-47、6-羥基-2，2’，4，4’-四溴二苯醚(6-OH-BDE-47)和6-甲氧基-2，2’，4，4’-四溴聯(lián)苯醚(6-MeO-BDE-47)干擾內(nèi)分泌和氧化應(yīng)激系統(tǒng)，產(chǎn)生的神經(jīng)毒性。此外，Costa等[29]研究發(fā)現(xiàn)BDE-47可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小鼠小腦顆粒神經(jīng)元氧化應(yīng)激，繼而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

本研究發(fā)現(xiàn)，BDE-47暴露能夠顯著抑制斑馬魚幼魚的運動行為，這與之前的研究相一致[14]。為在基因水平探討B(tài)DE-47的神經(jīng)發(fā)育毒性作用機制，探究了斑馬魚神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)情況。Elavl3基因編碼神經(jīng)特異性RNA結(jié)合蛋白Huc，被認(rèn)為是早期神經(jīng)元的生物標(biāo)記物[30]。在髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的mbp基因也被認(rèn)為是神經(jīng)發(fā)育的生物標(biāo)記物[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，BDE-47暴露顯著抑制神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因elavl3和mbp，產(chǎn)生的神經(jīng)毒性表現(xiàn)為斑馬魚幼魚運動行為抑制。轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(elavl3:EGFP) 使用神經(jīng)發(fā)育標(biāo)記基因elavl3的啟動子綠色熒光表達(dá)，兩者結(jié)果一致。

綜上所述， BDE-47暴露能夠顯著抑制斑馬魚幼魚的運動行為，這可能與神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)抑制有關(guān)。BDE-47暴露后，在轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(elavl3:EGFP)直觀地觀察到了中樞神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育受到顯著抑制，并且呈劑量依賴效應(yīng)，結(jié)合神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因表達(dá)量的抑制，進一步證實了BDE-47產(chǎn)生神經(jīng)毒性可能與中樞神經(jīng)發(fā)育被抑制有關(guān)。本研究關(guān)于BDE-47的神經(jīng)毒性機制研究還不夠深入，其確切毒性作用機制及其環(huán)境污染狀況、人群暴露和毒性作用亟待開展更為深入的研究。