對2015 年版《中國藥典》中茜草定量測定方法的改進(jìn)

楊 麗

（白銀市藥品檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 白銀 730900）

茜草系茜草科植物茜草Rubia cordifoliaL.的干燥根和根莖，隨著人們對中醫(yī)藥事業(yè)的關(guān)注度日益提高，其藥用價(jià)值也日益顯現(xiàn)［1-4］。2010、2015 年版《中國藥典》茜草中羥基茜草素、大葉茜草素的含有量測定方法采用一次過夜超聲、二次化學(xué)反應(yīng)提取后HPLC 法定量分析。但前期發(fā)現(xiàn)，在供試品溶液制備過程中一次提取方法的選擇、濾液的收集裝置、二次化學(xué)反應(yīng)的提取方法、裝置等問題值得商榷。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［5-7］，考察了供試品溶液制備過程中是否需要浸泡過夜、回流與水浴加熱凈化效果比較，以期為茜草質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 茜草來自甘肅省2019 年省評抽檢任務(wù)，經(jīng)白銀市藥品檢驗(yàn)檢測中心蘇學(xué)秀副主任中藥師鑒定為正品。大葉茜草素（批號110884-201606，純度99.5%）、羥基茜草素（批號111898-201603，純度98.5%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。磷酸、甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為自制超純水。

1.2 儀器 MSA 125P-1CE-DA 電子分析天平（德國賽多利斯公司）；EL204-IC 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置VWD 紫外檢測器（美國Agilent 公司）；恒溫水浴鍋。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），其他同2015 年版《中國藥典》（柱溫35 ℃；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL），色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液制備 參照2015 年版《中國藥典》方法制備，即得。

2.3 供試品溶液制備 取藥材（過2 號篩）約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入100 mL 甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（250 W、40 kHz）處理30 min，放冷至室溫，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，精密吸取續(xù)濾液50 mL與具塞錐形瓶中，蒸干，精密加入甲醇-25% 鹽酸（4∶1）20 mL，70 ℃下回流提取30 min，取出，立即冷卻，精密加入3 mL 三乙胺，立即蓋上瓶塞，勻速振搖后靜置30 min，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，甲醇少量多次洗滌容器內(nèi)壁，洗液并入量瓶中，定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材6 份，每份0.5 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定6 次，測得羥基茜草素、大葉茜草素含有量RSD 分別為1.5%、0.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取 “2.2”項(xiàng)下對照品溶液20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得羥基茜草素峰面積RSD 為1.2%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.4”項(xiàng)下供試品溶液1 份，室溫下于0、5、10、15、20、25 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣20 μL，測得羥基茜草素、大葉茜草素峰面積RSD 均為0.9%，表明供試品溶液在25 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 樣品含有量測定 取藥材粉末（過2 號篩），每批各2 份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法和2015 版《中國藥典》方法制備供試品溶液，精密吸取對照品、供試品溶液各20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，外標(biāo)法計(jì)算含有量，結(jié)果見表1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

3 討論

在一次提取階段，本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇、甲醇-25% 鹽酸（4∶1）作為溶劑［5-7］，超聲（250 W、40 kHz）處理30 min、浸泡過夜后超聲（250 W、40 kHz）處理30 min、加熱回流30 min、浸泡過夜后加熱回流30 min作為提取方法，正交試驗(yàn)進(jìn)行篩選，最終確定最優(yōu)方法為甲醇超聲（250 W、40 kHz）處理30 min。考慮到后續(xù)研究中蒸干容器對實(shí)驗(yàn)的重要影響，又考察了具塞錐形瓶、燒杯、蒸發(fā)皿，發(fā)現(xiàn)具塞錐形瓶蒸干效果最好。二次提取容器與一次提取相同，能大大減少因殘?jiān)芙獠煌耆蜣D(zhuǎn)移過程中灑漏而導(dǎo)致的偶然誤差。

在二次反應(yīng)階段，本實(shí)驗(yàn)比較了水浴上直接敞口加熱水解、回流加熱水解，確定為70 ℃下加熱回流水解，可節(jié)省檢驗(yàn)時(shí)間，避免溶劑揮發(fā)，減少檢驗(yàn)難度，提高實(shí)驗(yàn)效率。2015 年版《中國藥典》對加入三乙胺后的混勻時(shí)間未作出規(guī)定，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入3 mL 三乙胺后混勻30 min即可反應(yīng)完全，但此時(shí)由于發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，具塞錐形瓶中會(huì)產(chǎn)生大量白煙，故應(yīng)及時(shí)蓋上瓶塞以確保反應(yīng)完全發(fā)生。另外，反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至量瓶后加甲醇少量多次潤洗容器內(nèi)壁，洗液并入量瓶中用甲醇定容時(shí)，成分含有量更高。

表1 各成分含有量測定結(jié)果（n=10）

綜上所述，2015 年版《中國藥典》茜草中羥基茜草素、大葉茜草素含有量測定方法值得商榷。近年來，學(xué)者對茜草主成分含有量［8-9］及其指紋圖譜［10-12］進(jìn)行了研究，并標(biāo)定了10～15 個(gè)色譜峰。本實(shí)驗(yàn)通過與HPLC 色譜圖比對，發(fā)現(xiàn)隨著pH 變化大葉茜草素、羥基茜草素之間會(huì)相互轉(zhuǎn)化，故分別對兩者制訂標(biāo)準(zhǔn)并不能全面評價(jià)茜草質(zhì)量。因此，建議在2015 年版《中國藥典》中茜草含有量測定方法的供試品溶液制備項(xiàng)下，應(yīng)對一次提取方法、濾液收集裝置、二次化學(xué)反應(yīng)條件、加三乙胺后混勻時(shí)間、反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至量瓶是否需要沖洗等內(nèi)容進(jìn)行修訂，并將羥基茜草素、大葉茜草素總含有量作為指標(biāo)以使相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)更準(zhǔn)確、可靠、完善。