茜草炭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

張明童，張艷慧，馬瀟，宋平順，王娟弟，楊玲霞，李冬華

作者單位：1甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院、甘肅省中藏藥檢驗(yàn)檢測技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室、國家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070；2保定市食品藥品檢驗(yàn)所，河北 保定071000

茜草（Rubia cordifolia L.）的用藥部位為根及根莖，味苦，寒，歸肝經(jīng)，具有涼血，止血，通經(jīng)的功效［1］。未炒炭的茜草主要藥理作用為清熱涼血和活血，但其止血效果相對較差。而炒炭后降低其寒冷特性，增強(qiáng)其固化能力，從而更注重于止血功能。關(guān)于茜草的炮制最早記錄可以追溯到《雷公炮炙論》，雷公云：“凡使茜根，用銅刀于槐砧上銼，日干。勿犯鐵并鉛”［2］。茜草在歷史上的記錄中有多種不同的加工方法，包括凈制、炒制、釀制和炒炭等幾種方式。而現(xiàn)代其炮制品主要是凈制和炒炭。根據(jù)《全國中藥炮制規(guī)范》中茜草炭的炮制方法為“取茜草片或段置鍋內(nèi)，用武火加熱，炒至表面焦黑色，內(nèi)部棕褐色，噴淋清水少許，以將其撲滅，然后將其取出并晾干，直至完全冷卻”［3］。這種處理方式能夠促使大量的草酸鈣針晶分解成易于被人體吸收的鈣離子，進(jìn)而提高凝血酶原的作用效果，加快血液的凝聚進(jìn)程；同時(shí)，通過碳元素的釋出，可以減少毛細(xì)血管的滲透率，進(jìn)一步強(qiáng)化其收縮功能和抗出血的效果［4］。同時(shí)，現(xiàn)代研究表明經(jīng)過炒炭處理后，茜草的藥理作用，如活血、鎮(zhèn)痛和抗炎等，會減弱，但是它的止血作用明顯增強(qiáng)［5-9］，而茜草炭中異茜草素有明顯的止血作用［10-12］，可作為茜草炭含量測定的評價(jià)指標(biāo)［13-15］。

《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版一部中茜草炭，只收載了性狀、鑒別（化學(xué)反應(yīng)）、檢查（水分）和浸出物，這些內(nèi)容并不能全面評估其品質(zhì)。2022年6—8月采用薄層色譜和高效液相色譜的方法，通過比較茜草和相應(yīng)的炒炭品的薄層色譜和異茜草素含量的差異，以建立茜草炭飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并優(yōu)選茜草炭的炮制工藝。

1 儀器和材料

1.1 儀器 XMTD-4000型水浴鍋（北京永光明儀器公司），DHG-9245A型鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒儀器公司），KQ-700TDE型超聲波清洗器（昆山舒美儀器公司），LINOMAT5型薄層點(diǎn)樣儀（瑞士卡瑪公司），2695型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；XS 204型十萬分之一電子天平、ME 204型萬分之一電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］。

1.2 材料 乙醇，石油醚（60～90 ℃）、丙酮、甲醇、甲酸和磷酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純），甲醇、乙腈（德國默克股份有限公司，色譜純）；純化水（屈臣氏）。異茜草素對照品（成都埃法生物科技有限公司，批號AF21031209）。茜草及相應(yīng)的炮制品均購自河北仁心制藥有限公司，樣品信息見表1。10批茜草飲片（編號Q1～Q10）均購自河北仁心有限公司，為不同產(chǎn)地的茜草藥材切制的飲片，其中山西4批，陜西3批，河南3批。經(jīng)主任中藥師馬瀟鑒定為茜草科植物茜草的根及根莖。另外取干燥后的茜草飲片，炒藥溫度為350～370 ℃，炒5～7 min，至濃煙上冒，表面焦黑色，內(nèi)部棕褐色時(shí)，微噴水，滅盡火星，取出得茜草炭（編號T1～T10）。

表1 茜草及茜草炭的浸出物測定結(jié)果

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別 分別取0.5 g茜草和茜草炭粉末，過三號篩，加10 mL甲醇，采用超聲處理30 min后，進(jìn)行濾過。將濾液濃縮至1 mL，得到供試品溶液。同時(shí)取異茜草素對照品和大葉茜草素對照品，分別加入甲醇中制成含異茜草素0.5 mg和大葉茜草素0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。依照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗(yàn)，取上述四種溶液各5 μL，分別在硅膠G薄層板上點(diǎn)于同一位置。采用石油醚（60～90 ℃）-丙酮（2∶1）為展開劑進(jìn)行展開，取出并晾干，在紫外光燈（365 nm）下進(jìn)行檢視。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，茜草炭的薄層色譜和異茜草素對照品的色譜在相應(yīng)位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且分離程度和復(fù)現(xiàn)性良好。以異茜草素為茜草炭的指標(biāo)性成分，可明顯區(qū)分茜草和茜草炭，而茜草炒炭后大葉茜草素變化不明顯，不宜作為茜草炭薄層鑒別的指標(biāo)性成分，見圖1。

圖1 茜草與茜草炭薄層色譜圖

2.2 浸出物 根據(jù)2020年版《中國藥典》一部醇溶性浸出物測定法（通則2201）項(xiàng)下的熱浸法測定，對20批樣品進(jìn)行測定，每批樣本平行測定2次，取平均值后分別計(jì)算茜草和茜草炭的含量。

本研究中茜草飲片炒炭工藝制成的茜草炭浸出物含量明顯降低，10批茜草炒炭后浸出物含量范圍為6.3%～10.9%，為茜草飲片的56.4%～63.5%。

2.3 異茜草素含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：資生堂CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，等度洗脫（50∶50）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見圖2。

圖2 對照品和茜草炭HPLC圖：A為異茜草素對照品；B為茜草炭

2.3.2 供試品溶液的制備 取供試品（過三號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率400 W，頻率80 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 對照品溶液的制備 精密稱取異茜草素適量，加甲醇制成濃度0.82 g/L的對照品溶液，備用。

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別吸取濃度為0.82 g/L的對照品溶液各0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到系列濃度的對照品溶液。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制線性曲線，其線性回歸方程為Y=2 876X+1 464（r=0.999 9）。在8.2～820.0 mg/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) “2.3.3”的對照品溶液被用于精密度的測試中，根據(jù)“2.3.1”中的步驟進(jìn)行了六次重復(fù)測定，并將測量到的峰面積記錄下來，然后計(jì)算了RSD值。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是RSD僅有0.6%（n=6），表明設(shè)備具有良好的精確度和穩(wěn)定性能。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對同一批次供試品溶液（即茜草炭T2）進(jìn)行穩(wěn)定性考察，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法測定，分別在0、4、8、12、16、24 h內(nèi)測量其峰面積。測的異茜草素含量變化的RSD為1.8%，表明該批次溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取茜草炭（T2）供試品約1 g，精密稱定，平行6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，并按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，測得異茜草素含量的RSD為2.4%，表明該分析方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的樣品（茜草炭T2）約1 g，精密稱定，平行9份，置具塞錐形瓶中，按50%、100%、150%的比例分別加入濃度為0.82 g/L異茜草素對照品溶液適量，按供試品溶液的方法制備，計(jì)算回收率，見表2?；厥章试囼?yàn)結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表2 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.9 異茜草素含量測定結(jié)果 稱取茜草和茜草炭供試品各10批，每批約1 g，精密稱定，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，并按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，樣品測定2次取平均值，計(jì)算茜草和茜草炭中異茜草素的含量，分析炮制前后的變化。結(jié)果見表3。茜草炒炭后異茜草素明顯升高，茜草中異茜草素含量0.009%～0.017%，茜草炭中異茜草素含量0.065%～0.117%，因此擬定茜草炭中異茜草素的含量限度為0.060%。

表3 異茜草素含量測定結(jié)果

3 討論

《中國藥典》2020年版一部茜草炭缺少薄層色譜的定性鑒別項(xiàng)目，本研究通過不同條件試驗(yàn)，最終以石油醚（60～90 ℃）與丙酮（2∶1）作為展劑，置紫外光燈（365 nm）下檢視，以異茜草素為茜草炭的特征成分，可明顯區(qū)分茜草和茜草炭。該方法專屬性好、靈敏高、分離度和重現(xiàn)性良好。本研究可為茜草炭標(biāo)準(zhǔn)提升提供科學(xué)依據(jù)。

茜草炒炭后浸出物含量明顯降低，為茜草飲片的56.4%～63.5%，可能是高溫使有機(jī)物炭化，浸出物含量下降。本研究前期比較了不同炒炭程度對浸出物的影響，結(jié)果表明炒輕炭浸出物高于炒重炭，但是僅從浸出物含量的高低評價(jià)茜草炭是否炮制完全還存在一定的片面性，因此以什么標(biāo)準(zhǔn)來評價(jià)其“炒炭存性”還有待進(jìn)一步研究。

茜草生用有涼血止血作用，炒炭后能增強(qiáng)止血作用。本研究發(fā)現(xiàn)茜草經(jīng)炒炭后異茜草素含量明顯增高，可能是在受熱過程中茜草中蒽醌類結(jié)構(gòu)發(fā)生改變轉(zhuǎn)化為異茜草素，但是增加與減少的成分之間關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，異茜草素有明顯的止血作用，是茜草炭主要止血成分之一［16-20］，因此可以作為茜草炭的含量測定指標(biāo)。研究建立的含量測定方法簡單易行，分離度好、靈敏度高、專屬性和耐用性良好。