還陽(yáng)參UPLC 指紋圖譜及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

苗雨露，張?chǎng)┫?，張文智，馮 敏，李媛媛，倪 艷*

（1.山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030045；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原 030619）

還陽(yáng)參為菊科植物還陽(yáng)參屬屠還陽(yáng)參Crepis crocea（Lamk）Babc 的干燥全草，最早收載于 《內(nèi)蒙古中草藥》，其味苦，性微寒，有益氣、止咳平喘、清熱解毒之功效，主產(chǎn)于山西、內(nèi)蒙古等北部地區(qū)，別名為 “驢打滾兒草”“屠還陽(yáng)參”等［1］。其使用歷史悠久，現(xiàn)已被《山西省中藥材中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)》收錄。民間常用還陽(yáng)參煎湯醫(yī)治喘息性慢性支氣管炎、無(wú)名腫毒等，治療效果明顯。本課題組從1998 年開(kāi)始對(duì)還陽(yáng)參進(jìn)行資源調(diào)查，并用科學(xué)的方法研究其藥理作用和化學(xué)成分，以期闡明其安全性和有效性。課題組針對(duì)還陽(yáng)參藥理作用及化學(xué)成分進(jìn)行研究，并確認(rèn)其止咳平喘、益氣作用的活性物質(zhì)。藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，還陽(yáng)參醇提物石油醚部位通過(guò)減少小鼠咳嗽次數(shù)、延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期發(fā)揮止咳作用［2］，正丁醇部位通過(guò)抑制組胺和乙酰膽堿對(duì)豚鼠引起的哮喘發(fā)揮平喘作用［3］。除此之外，還研究了還陽(yáng)參止咳平喘藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，且從其活性部位分離出一些化學(xué)成分，均為首次從中分離得到［4］?！渡轿魇≈兴幉闹兴庯嬈瑯?biāo)準(zhǔn)》中以綠原酸的含有量（不少于0.06%）作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)［5］。

UPLC 指紋圖譜能較全面地得到中藥中的化學(xué)成分的相對(duì)含有量，更好地評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量［6-13］。其作為中藥研究領(lǐng)域使用較多且較有效的手段之一，該方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、應(yīng)用便捷。本實(shí)驗(yàn)建立還陽(yáng)參UPLC 指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)綜合評(píng)價(jià)還陽(yáng)參藥材，以期找到指標(biāo)成分，建立更合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1290 infinity Ⅱ高效液相色譜儀、Agilent G4 212 A DAD 檢測(cè)器、ChemStation 色譜數(shù)據(jù)工作站（美國(guó)Agilent 公司）；FW-100 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；LC-300B 型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（山東濟(jì)寧魯超聲設(shè)備有限公司）；SE402F 奧豪斯型電子分析天平（奧豪斯儀器上海有限公司）。

1.2 試藥 樣品信息見(jiàn)表1，經(jīng)山西省中醫(yī)藥研究院倪艷教授鑒定為菊科植物屠還陽(yáng)參Crepis crocea（Lamk）Babc的干燥全草。綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753-201314，含有量大于98%）、咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)110885-200102，含有量大于98%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈（色譜純，西隴科學(xué)股份有限公司）；甲酸（分析純，批號(hào)20030602，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司）；水為超純水。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 色譜條件 Zorbax SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，5%～10% A；20～30 min，10%～20% A；30～40 min，20%～50% A；40～41 min，50%～5% A；41～45 min，5%A）；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量1 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)329 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取綠原酸、咖啡酸對(duì)照品，加入甲醇制備成含綠原酸 0.125 1 mg/mL、咖啡酸0.141 2 mg/mL的對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取還陽(yáng)參藥材粉末（過(guò)5 號(hào)篩）1.5 g，加70% 甲醇15 mL，超聲（300 W、40 kHz）提取30 min，靜置冷卻，再用70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，過(guò)濾，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取還陽(yáng)參藥材（S1），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積RSD 均小于0.7%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取還陽(yáng)參藥材（S1），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)得各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積RSD 均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取還陽(yáng)參藥材（S1）6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得各峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD 均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1 指紋圖譜建立 綠原酸和咖啡酸對(duì)照品按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，得到綠原酸和咖啡酸對(duì)照品液相色譜圖，見(jiàn)圖1。按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，得色譜圖，將10 批樣品色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2008A 版），S6 為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)、時(shí)間窗為0.2 的方法，得到10 批樣品指紋圖譜見(jiàn)圖2，及對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖3，確定18 個(gè)共有峰。

圖2 10 批樣品UPLC 指紋圖譜

圖3 還陽(yáng)參對(duì)照指紋圖譜

2.4.2 相似度分析 通過(guò)與對(duì)照品溶液色譜圖比對(duì)，確認(rèn)5 號(hào)峰為綠原酸，6 號(hào)峰為咖啡酸。因5 號(hào)峰在各樣品中均存在，且含有量較高，分離度較好，故選取其為參照峰（S），計(jì)算得到18 個(gè)共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見(jiàn)表2～3。采用“色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2008A 版”軟件計(jì)算10 批樣品和對(duì)照指紋圖譜之間的相似度，分別為0.970、0.996、0.996、0.995、0.996、0.997、0.998、0.998、0.998、0.988，均在0.970 以上，表明10批還陽(yáng)參質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

2.5 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析 相似度評(píng)價(jià)難以看出10 批藥材之間的差異，需要進(jìn)一步采用聚類分析和主成分分析明確藥材的差異，更好的評(píng)價(jià)10 批還陽(yáng)參藥材質(zhì)量。

2.5.1 聚類分析 將10 批樣品18 個(gè)共有峰面積導(dǎo)入SPSS23.0 版軟件，然后標(biāo)準(zhǔn)化處理進(jìn)行聚類分析，得到10×18階數(shù)據(jù)矩陣，以組間平均鏈鎖距離及歐氏距離平方作為樣品測(cè)度。結(jié)果見(jiàn)圖4。

表2 10 批樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表3 10 批樣品共有峰相對(duì)峰面積

結(jié)果顯示，當(dāng)判別條件距離為15 時(shí)，10 批樣品被分為4 大類，第1 類包括S2、S3、S4、S5、S7、S8；第2 類包括S9、S10；第3 類包括S6；第4 類包括S1。當(dāng)判別條件距離為20 時(shí)，10 批樣品被分為2 大類，1 類包括S1；剩下的為另1 類。結(jié)果表明，分類情況與產(chǎn)地?zé)o關(guān)，可能是由于化學(xué)成分含有量差異導(dǎo)致。結(jié)果與相似度分析結(jié)果基本一致。

2.5.2 主成分分析 將18 個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 23.0軟件，然后對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，將處理后的共有峰峰面積進(jìn)行主成分分析，相關(guān)矩陣的特征值及其方差見(jiàn)表4，結(jié)果見(jiàn)圖5～6，前4 個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為89.614%。

表4 主成分的初始特征值和累積貢獻(xiàn)率

圖4 10 批樣品聚類樹(shù)狀圖

由表5 可得，中藥化學(xué)成分眾多，多成分相互作用才是影響還陽(yáng)參藥材質(zhì)量差異的重要原因。4、7、11、12、15、17 號(hào)色譜峰對(duì)第一主成分的作用在0.7 以上，是影響第一主成分的主要來(lái)源；1、2、9、10、14 號(hào)色譜峰對(duì)第二主成分的作用在0.7 以上，是影響第二主成分的主要來(lái)源；5、8 號(hào)色譜峰對(duì)第三主成分的作用在0.8 以上，是影響第三主成分的主要來(lái)源；第4 主成分主要來(lái)自色譜峰10 的信息。

表5 初始因子載荷矩陣

將10 批還陽(yáng)參藥材中18 個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA-P13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行PCA 分析，得到PCA 得分圖（圖5）、各成分柱狀圖（圖6）。

圖5 可直觀看到10 批還陽(yáng)參藥材質(zhì)量的差異，藥材1與其他樣本距離較遠(yuǎn)，3、4、5 距離較近，6、7、8 距離較近，分類結(jié)果與HCA 結(jié)果基本一致。PCA 結(jié)果與HCA 的結(jié)果可以相互驗(yàn)證。

圖6 代表各個(gè)色譜峰對(duì)還陽(yáng)參藥材質(zhì)量差異的貢獻(xiàn)值，其中9 號(hào)峰貢獻(xiàn)值最大、依次類推2、14、10、6、5 號(hào)色譜峰貢獻(xiàn)值較大?？梢哉J(rèn)為這6 個(gè)色譜峰是影響還陽(yáng)參藥材質(zhì)量差異的主要色譜峰，經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)，5、6 號(hào)峰分別為綠原酸和咖啡酸，剩余色譜峰還需結(jié)合核磁、液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)手段進(jìn)一步鑒別確認(rèn)。

圖5 10 批樣品主成分分析圖

圖6 各成分柱狀圖

3 討論

3.1 提取方法和色譜條件考察 參考文獻(xiàn)［14］，本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溶劑、提取方法、提取次數(shù)及提取時(shí)間進(jìn)行考察，以色譜峰數(shù)目、分離度、基線平穩(wěn)程度為主要考慮因素，發(fā)現(xiàn)70%甲醇超聲提取30 min，提取1 次，提取率較好，雜質(zhì)干擾少。

考察了流動(dòng)相乙腈、甲醇、0.1%甲酸、0.1%乙酸、0.1%磷酸，柱溫25、26、27、28、29、30 ℃，波 長(zhǎng)210、254、329 nm，最終確定“2.1”項(xiàng)下條件，此條件下基線平穩(wěn)，色譜峰出峰時(shí)間合適，色譜峰個(gè)數(shù)較多，分離效果較好。

3.2 指紋圖譜建立 建立了10 批樣品UPLC 指紋圖譜，共標(biāo)定了18 個(gè)共有峰，以對(duì)照指紋圖譜為參照，計(jì)算相似度，結(jié)果顯示10 批還陽(yáng)參藥材相似度均大于0.970，表明10 批樣品質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。且共有峰保留時(shí)間相差較小，但峰面積相差較大，表明不同批還陽(yáng)參化學(xué)成分含有量差異較大［15-16］。

3.3 化學(xué)模式識(shí)別 以5 號(hào)峰綠原酸為參照峰，對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，進(jìn)行聚類分析和主成分分析。當(dāng)判別條件距離為20 時(shí)，10 批樣品被分為2 類，結(jié)果表明，分類情況與產(chǎn)地?zé)o關(guān)，可能是由于化學(xué)成分含有量差異導(dǎo)致。主成分分析圖顯示S1 與其他批次樣品相距較遠(yuǎn)，圖6 顯示，影響還陽(yáng)參藥材質(zhì)量差異的主要有6 個(gè)色譜峰。聚類分析、主成分分析及相似度結(jié)果基本一致，表明本實(shí)驗(yàn)建立的還陽(yáng)參藥材指紋圖譜具有可靠性。

本實(shí)驗(yàn)首次建立了還陽(yáng)參UPLC 指紋圖譜，較全面地反映了還陽(yáng)參藥材化學(xué)成分的數(shù)目和含有量情況。結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、聚類分析和主成分分析共同區(qū)分10 批樣品，綜合評(píng)價(jià)其指紋圖譜，試圖找到影響其質(zhì)量差異的指標(biāo)成分，為建立更加合理的還陽(yáng)參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。