凍干地黃、生地黃HPLC 指紋圖譜

譚麗媛，陳 瑾，王旭文，翟康欣，李 敏，張淑蓉*

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，山西 晉中 030600；2.山西振東安特生物制藥有限公司，山西 晉中 030600）

地黃是玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.新鮮或干燥的塊根［1］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品。生地黃味甘、性寒，具有養(yǎng)陰生津、清熱涼血的功效，現(xiàn)代藥理研究表明其具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗腫瘤、抗炎等作用，在臨床上應(yīng)用廣泛［2］。地黃主產(chǎn)于河南、山西、河北、遼寧、山東等地，歷來以河南產(chǎn)懷地黃為道地藥材；因地黃忌連作，與河南一河之隔的山西近年來成為地黃主產(chǎn)地之一。真空冷凍干燥所得凍干地黃不易變質(zhì)，能更有效保留地黃的活性成分［3］，雖真空冷凍干燥設(shè)備投資成本高，但長期應(yīng)用效率高且能耗低，山西省中藥材、中藥飲片地方標(biāo)準(zhǔn)擬收載凍干地黃炮制品。本實(shí)驗(yàn)以梓醇、地黃苷A、毛蕊花糖苷等為參照，對同批鮮地黃炮制所得凍干地黃和生地黃進(jìn)行HPLC 指紋圖譜研究，以期為地黃炮制品的質(zhì)量控制和評價(jià)提供依據(jù)。

1 材料

Waters 高效液相色譜儀（515 泵、2996 檢測器，2695泵、2998 檢測器，Empower 工作站，美國Waters 公司）；SB-800 DTD 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；AB135-S 分析天平（十萬分之一，瑞士Mettler Toledo公司）；CP214 分析天平（萬分之一，上海舜宇平科學(xué)儀器有限公司）。

地黃藥材產(chǎn)地為山西、河南，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)裴香萍副教授鑒定為正品。梓醇（批號110808-200104）、毛蕊花糖苷對照品（批號111530-201208）均購于中國食品藥品檢定研究院；地黃苷A 對照品（批號20120317）購于寶雞市辰光生物科技有限公司。水為雙蒸水，乙腈（色譜純，批號12960217，瑞典歐森巴克化學(xué)公司）；磷酸等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hypersil ODS2色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.02%磷酸水溶液，梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長205 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取梓醇、地黃苷A、毛蕊花糖苷對照品，加20%甲醇制成每1 mL 分別含梓醇0.87 mg、地黃苷A 1.25 mg、毛蕊花糖苷0.48 mg 的對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 分別取凍干地黃粉末（過2 號篩）、生地黃（取生地黃切成小塊約5 mm，經(jīng)減壓干燥80 ℃，24 h 后，磨成粗粉）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，精密量取，稱定質(zhì)量，搖勻，冷浸過夜（12 h），超聲（功率250 W，頻率35 kHz）處理1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，水浴蒸至近干，20%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，并用20%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得［4-6］。

2.3 測定方法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄120 min 的色譜圖。

表1 梯度洗脫程序

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取凍干地黃樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄高效液相色譜圖，通過相似度評價(jià)軟件計(jì)算相似度，結(jié)果均大于0.99，表明儀器精密度良好［7-9］。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取凍干地黃樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于0、4、8、16、24、48 h 進(jìn)樣測定，記錄高效液相色譜圖，通過相似度評價(jià)軟件計(jì)算相似度，結(jié)果均大于0.99，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取凍干地黃和生地黃樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法分別平行制備供試品溶液6 份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，記錄高效液相色譜圖，通過相似度評價(jià)軟件計(jì)算相似度，結(jié)果凍干地黃和生地黃相似度均大于0.98，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 耐用性試驗(yàn) 對不同色譜柱Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xterra C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Aichrom Bond-AQ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和不同色譜儀Waters（515 泵、2996 檢測器，2695 泵、2998 檢測器，Empower 工作站）及Agilent Technologies1200 series 分別進(jìn)行了考察，結(jié)果不同的色譜柱和色譜儀重復(fù)性良好。且柱溫對精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性等影響較大，經(jīng)考察柱溫以30 ℃為宜。

2.5 指紋圖譜建立 分別取10 批凍干地黃和生地黃樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，記錄高效液相色譜圖，確定了8 個(gè)共有峰，見圖1；運(yùn)用中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2010A 版”對所得指紋圖譜進(jìn)行分析，見圖2～3。

圖1 凍干地黃樣品各成分HPLC 色譜圖

圖2 10 批凍干地黃HPLC 指紋圖譜

圖3 10 批生地黃HPLC 指紋圖譜

2.6 相似度分析 對10 批凍干地黃和生地黃的的指紋圖譜分別進(jìn)行相似度評價(jià)，結(jié)果見表2～3；對10 批凍干地黃和生地黃共同進(jìn)行相似度評價(jià)，結(jié)果見表4。

2.7 聚類分析 運(yùn)用SPSS 20.0 軟件對10 批凍干地黃指紋圖譜進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用組間聯(lián)接法，利用歐氏距離平方作為樣品的測度，結(jié)果見圖4。10 批凍干地黃樣品聚類分為2 大類，山西運(yùn)城地區(qū)的永濟(jì)、臨猗、萬榮及侯馬聚為1 類，山西臨汾地區(qū)洪洞、襄汾、浮山及河南焦作聚為2 類，表現(xiàn)出明顯的地域特征。山西臨汾產(chǎn)地黃與河南產(chǎn)地黃相似度極高，佐證了李衛(wèi)民等［10］對地黃道地藥材變遷的思考。

表2 10 批凍干地黃樣品相似度

表3 10 批生地黃樣品相似度

表4 10 批生地黃、凍干地黃樣品相似度

圖4 10 批凍干地黃樣品聚類樹狀圖

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，凍干地黃、生地黃的指紋圖譜相似度均大于0.9，相似度良好；而將10 批凍干地黃和生地黃共同進(jìn)行評價(jià)，相似度在0.611～0.749 之間，表明凍干地黃和生地黃質(zhì)量存在明顯差異，本實(shí)驗(yàn)所建立的指紋圖譜能有效區(qū)分凍干地黃和生地黃。凍干地黃和生地黃指紋圖譜的主要差異在于化學(xué)成分含有量的不同（凍干地黃多數(shù)共有峰面積明顯大于生地黃），此與本課題組前期報(bào)道的結(jié)果一致［3］，表明凍干地黃比生地黃能夠有效保留活性成分。

實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)［1，11-17］，針對地黃主要活性成分地黃苷A、地黃苷D、梓醇、毛蕊花糖苷等極性較大的特點(diǎn)，對提取溶劑（水、甲醇、乙醇）、提取方法（冷浸、回流、超聲、冷浸+回流或超聲）、提取時(shí)間（0.5、1、1.5 h，冷浸均為12 h）、流動相（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-不同濃度磷酸溶液）和供試品溶液制備的定容溶劑（1∶99的乙腈-0.02% 磷酸、不同濃度甲醇）等進(jìn)行考察，確定了“2.1”項(xiàng)下條件。另外，在凍干地黃、生地黃HPLC 指紋圖譜中，保留時(shí)間95～120 min 也出現(xiàn)一些穩(wěn)定色譜峰，經(jīng)考察為溶劑造成，故選取95 min 之前的色譜圖進(jìn)行指紋圖譜評價(jià)。