47個常染色體InDel位點在中國5個民族中的遺傳多態(tài)性及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510080；2.廣州市越秀區(qū)公安司法鑒定中心，廣東 廣州510080；3.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東 廣州 510030；4.中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司，江蘇 無錫214174；5.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515）

STR是目前法醫(yī)學(xué)個體識別和親子鑒定中最常用的多態(tài)性遺傳標(biāo)記，具有高靈敏度和快速檢測的優(yōu)勢[1-2]。然而，隨著STR的廣泛應(yīng)用，逐漸體現(xiàn)出其局限性：突變率相對較高[3]，在親子鑒定中可能導(dǎo)致誤判；擴增子相對較長，限制了其在高度降解檢材中的應(yīng)用[4]；在人類基因組的數(shù)量有限，限制了其在復(fù)雜遺傳關(guān)系鑒定中的應(yīng)用。相比之下，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）和插入/缺失（insertion/deletion，InDel）可以彌補這些局限性，其突變率低、擴增片段短、數(shù)量龐大且分布廣泛，故而在法醫(yī)學(xué)研究中受到越來越多的關(guān)注[5]。而相比SNP，InDel可以采用目前法醫(yī)DNA鑒定領(lǐng)域常用的多重PCR復(fù)合擴增聯(lián)合毛細管電泳分型技術(shù)進行檢測，相對快速和經(jīng)濟，因而更受關(guān)注[6-7]。

目前，已有研究針對不同人群設(shè)計了多重InDel擴增體系并評估其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用，結(jié)果表明具有良好的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值[7-10]。其中，最常見的是德國Qiagen公司的商業(yè)試劑盒Investigator DIPplex，包含30個常染色體InDel位點和Amelogenin性別位點。已有多個研究驗證了該試劑盒在歐洲人群的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用效能[11-18]，然而，在包括中國在內(nèi)的幾個亞洲人群中，由于數(shù)個InDel的多態(tài)性較低使其在亞洲人群的應(yīng)用受到限制[19-24]。因此，LI等[25]根據(jù)中國漢族人群的等位基因頻率設(shè)計了一個包含29個InDel位點的多重PCR復(fù)合擴增體系，驗證發(fā)現(xiàn)該擴增體系在中國人群的累積個體識別率（cumulative discrimination power，CDP）為0.999999999990867，非父排除率為0.9930，可用于個體識別或親子鑒定。

考慮到納入更多InDel位點可提高法醫(yī)學(xué)應(yīng)用效能，我們在前期研究中基于中國北京漢族人群的等位基因頻率構(gòu)建了AGCU InDel 50試劑盒，其包含47個常染色體InDel位點、2個Y-InDel位點和Amelogenin性別位點[26]。本研究擬應(yīng)用該試劑盒對中國廣東漢族、廣西壯族、廣西瑤族、廣西京族和廣西仫佬族5個民族共768名無關(guān)個體進行遺傳多態(tài)性調(diào)查，并評估該試劑盒的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用效能，為其在個體識別和親權(quán)鑒定中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集和DNA提取

所有參與實驗者均經(jīng)知情同意后自愿參加。采集768名無關(guān)個體外周血樣，包括廣東漢族163例、廣西壯族162例、廣西瑤族128例、廣西京族155例、廣西仫佬族160例。采用5%Chelex-100快速提取法提取基因組DNA[27]。

本實驗符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》，并獲得中山大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 PCR擴增

采用AGCU InDel 50試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）在ProFlexTMPCR擴增儀（美國Applied Biosystems公司）上進行復(fù)合擴增，方法同文獻[26]。

1.3 毛細管電泳和數(shù)據(jù)分析

在3500xL基因分析儀（美國Applied Biosystems公司）上使用6 Dye Matrix標(biāo)準(zhǔn)品（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）進行光譜校正，使用36 cm毛細管和POP-4?分離膠（美國Applied Biosystems公司）檢測擴增產(chǎn)物。

將擴增產(chǎn)物以離心半徑7.3cm，3000r/min，離心5 min 后 ，取 1 μL 擴增產(chǎn)物 與 0.5 μL AGCU Marker SIZ-500（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）和12μL Hi-DiTMFormamide（美國Applied Biosystems公司）混合，95℃變性3min后立即冰浴3min，然后電泳檢測。

用GeneMapper?ID-Xv1.4軟件（美國Applied Biosystems公司）對電泳原始數(shù)據(jù)進行分析。InDel位點中的插入（insertion）等位基因和缺失（deletion）等位基因分別命名為I和D，Amelogenin基因座的兩個等位基因分別為X和Y。

1.4 質(zhì)量控制

每批實驗樣本檢測均采用標(biāo)準(zhǔn)品9948（0.5ng/μL，美國Promega公司）和超純水分別作為擴增的陽性對照和陰性對照。

1.5 統(tǒng)計分析

運用PowerStats v12軟件（美國Promega公司）統(tǒng)計分析47個常染色體InDel位點的等位基因頻率、個體識別率（discrimination power，DP）、三聯(lián)體非父排除率（probability of exclusion of trios-testing，PEtrio）、多態(tài)信息含量（polymorphic information content，PIC）和典型親權(quán)指數(shù)（typical paternity index，TPI）等群體遺傳學(xué)參數(shù)。

采用GENEPOP v4.2軟件（http://genepop.curtin.edu.au/）檢驗Hardy-Weinberg平衡。用SNPAnalyzer 2.0軟件[28]分析連鎖不平衡。

觀察雜合度（observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）及群體間遺傳差異使用Arlequin v3.5軟件[29]計算分析。

2 結(jié) 果

2.1 連鎖不平衡分析

經(jīng)Bonferroni校正，連鎖不平衡分析結(jié)果顯示，在5個民族中，47個常染色體InDel位點均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象。

2.2 等位基因頻率及其分布差異

47個常染色體InDel位點在5個民族中的缺失等位基因頻率分別為廣東漢族0.224～0.699、廣西壯族0.182～0.744、廣西瑤族0.063～0.883、廣西京族0.071～0.845、廣西仫佬族 0.097～0.769。其中，rs139934789位點在廣西瑤族、廣西京族、廣西仫佬族人群中的缺失等位基因頻率極低，分別為0.063、0.071和0.097。經(jīng)Bonferroni校正，Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果顯示：47個常染色體InDel位點在廣東漢族和廣西壯族中的等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡分布；在廣西瑤族、廣西京族、廣西仫佬族中，除了rs139934789位點（P=0.0000）外，其他46個常染色體InDel位點的等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡分布。詳見表1。

經(jīng)Bonferroni校正，等位基因頻率比較結(jié)果顯示：廣東漢族和廣西壯族之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，廣東漢族和廣西瑤族、廣西京族、廣西仫佬族之間分別有10、3、1個常染色體InDel位點差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

表1 47個常染色體InDel位點在5個民族中的等位基因頻率Tab.1 Allele frequencies of the 47 autosomal InDel loci in 5 ethnic groups

續(xù)表1Continued tab.1

表2 廣東漢族與其他4個民族的等位基因頻率比較（P值）Tab.2 Comparisons of the allele frequencies between Guangdong Han nationality and the other 4 ethnic groups（P value）

群體間遺傳差異分析結(jié)果顯示，47個常染色體InDel位點在5個民族中的遺傳差異有1.12%來自不同民族之間，有98.88%來自不同個體之間。

2.3 群體遺傳學(xué)參數(shù)

在廣東漢族和廣西壯族人群中，Ho分別為0.350～0.564、0.284～0.568。在廣西瑤族、廣西京族和廣西仫佬族人群中，rs139934789位點的Ho分別為0.000、0.000、0.006，其余位點的 Ho分別為 0.219～0.602、0.271～0.574和0.319～0.556，同時，該位點在這3個民族中的PIC較低，分別為0.110、0.123、0.160，詳見表3。

在廣東漢族和廣西壯族人群中，DP值分別為0.514～0.648、0.463～0.648，PEtrio值分別為0.086～0.250、0.057～0.254。在廣西瑤族、廣西京族和廣西仫佬族人群中，rs139934789位點的DP值分別為0.117、0.132、0.181，PEtrio值均為0.000；其余位點的DP值分別為0.354～0.653、0.423～0.655、0.479～0.662，PEtrio值分別為0.035～0.293、0.052～0.261、0.072～0.242。詳見表3。

5個民族的CDP均高于0.999 999 999 999 999，累積三聯(lián)體非父排除率（cumulative probability of exclusion of trios-testing，CPEtrio）分別為廣東漢族0.99973216、廣西壯族0.999 549 23、廣西瑤族0.999 054 61、廣西京族0.999 636 29、廣西仫佬族0.99947179。詳見表3。

2.4 Y-InDel位點檢測結(jié)果

2個Y-InDel位點在所有男性個體中均被檢出，而在所有女性個體中均未被檢出。

表3 47個常染色體InDel位點在5個民族中的群體遺傳學(xué)參數(shù)Tab.3 Population genetic parameters of 47 autosomal In Del markers in5 ethnicgroups

3 討 論

本研究采用AGCU InDel 50試劑盒對廣東漢族、廣西壯族、廣西瑤族、廣西京族和廣西仫佬族5個民族768名無關(guān)個體進行遺傳多態(tài)性調(diào)查，并評估該試劑盒在5個民族中的法醫(yī)學(xué)效能。結(jié)果表明，該試劑盒可以用于上述5個民族人群的法醫(yī)學(xué)個體識別。與以往研究[21-25，30-31]的檢測體系相比，該試劑盒包含的InDel位點數(shù)相對較多，所以CDP均高于0.999 999 999 999 999；但由于CPEtrio在5個民族中均小于0.9999，因此不適合單獨用于親權(quán)鑒定，只能作為常規(guī)STR分型試劑盒的有效補充。此外，該試劑盒包含的2個Y-InDel位點可以有效地提高Y染色體的識別度，可聯(lián)合Amelogenin性別位點確定個體性別。

雖然多個InDel位點的等位基因頻率分布在不同群體間存在差異，可能在一定程度上影響其在人群中的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用，如rs151335218位點在廣東漢族和廣西京族人群中的等位基因頻率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0000），但DP值卻相近（廣東漢族0.613、廣西京族0.592），因此，這種頻率差異不影響該試劑盒在這5個民族中的適用。此外，群體間遺傳差異分析結(jié)果顯示，5個民族之間的遺傳變異僅占總遺傳多樣性的1.12%，而主要的遺傳變異是個體差異造成的，這也表明該試劑盒在這5個民族中具有適用性。

本研究47個常染色體InDel位點中，rs139934789在廣西瑤族、廣西京族和廣西仫佬族人群中均缺乏多態(tài)性（Ho分別為0.000、0.000、0.006），且不符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.0000），這可能是由于本研究47個InDel位點是基于數(shù)據(jù)庫中漢族人群的數(shù)據(jù)篩選納入的，因而可能存在個別位點的多態(tài)性在其他民族較漢族有差異。5個民族中除漢族來自廣東外，其余4個民族均來自廣西，因此，廣東漢族與其余4個民族的差異除來自民族間的差異外，可能還存在廣東與廣西地區(qū)間的差異，而4個民族之間的差異，則主要來自民族間的差異。在今后的試劑盒優(yōu)化中，可以考慮尋找其他適合中國人群的InDel位點來替代rs139934789位點，同時進一步增強該擴增體系的親權(quán)鑒定效能。

本研究獲得了47個常染色體InDel位點在5個民族人群中的等位基因頻率及基因型分布數(shù)據(jù)，為建立中國人群InDel分布數(shù)據(jù)庫及遺傳關(guān)系的分析提供了良好的遺傳背景數(shù)據(jù)，有助于將來群體遺傳的多樣性研究。