PCV4 SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立及應(yīng)用

黃小武，杜 倩，閉璟珊，韋正吉，鄒聯(lián)斌，趙子欣，閆修魁，韓知曉，辛佳亮，鄭 敏

（1.柳州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西柳州 537000；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530001；3.廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）、圓環(huán)病毒屬（Circovirus），是目前發(fā)現(xiàn)最小的病毒之一[1]。PCV為無(wú)囊膜單股正鏈環(huán)狀DNA病毒，病毒基因組全長(zhǎng)約1.7～2.0 kb，包含兩個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框ORF1和ORF2，分別編碼復(fù)制酶蛋白（replicase protein，Rep）[2]和衣殼蛋白（capsid protein，Cap）[3]。其中Cap蛋白包含多個(gè)中和抗體表位[4]。2019年之前，僅發(fā)現(xiàn)了PCV的3個(gè)成員。其中，PCV1對(duì)豬沒(méi)有致病性；PCV2和PCV3被認(rèn)為是豬圓環(huán)病毒病的主要病原體，可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）和豬皮炎與腎病綜合征（porcine dermatitis nephropathy syndrome，PDNS）等臨床疾病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。

2019年，我國(guó)在湖南省患有呼吸道、消化道疾病和PDNS的豬群中首次檢測(cè)到了另一種新型豬圓環(huán)病毒——PCV4，其與PCV1～3型具有明顯的遺傳差異[6]。為進(jìn)一步了解PCV4在國(guó)內(nèi)外的流行情況，迫切需要一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高及特異性好的檢測(cè)方法，為此，本研究擬建立一種針對(duì)PCV4的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，以期為PCV4相關(guān)疫病的早期診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

PCV1（GXdx115、KX827778），PCV2（疫苗株SX07株），PCV3（Shandong-01、MH107161），豬流行性腹瀉病毒（PEDV，疫苗株CV777株）和豬繁殖與障礙呼吸綜合征病毒（PRRSV，疫苗株TJM-F92株）等，均由廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存；56份豬臨床樣本，采集于廣西南寧、桂林及河池等地豬場(chǎng)；FastPure? Plasmid Mini Kit質(zhì)粒小提試劑盒、FastPure? Blood/Cell/Tissue/Bacteria DNA Isolation Mini Kit及DL 15 000 DNA Marker，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；SYBR Green I PCR Master Mix，購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI上已發(fā)表的PCV4基因序列（GenBank登錄號(hào)MK986820.1），選取Rep基因保守區(qū)域，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，PCV4-QF：5'-AAACAGCATATTGACGCTGG-3'；PCV4-QR：5'-CGTTCTGTGCCTGGAATGAT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為146 bp。引物由華大基因科技有限公司合成。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒制備

選擇PCV4Rep基因保守區(qū)域送華大基因合成，克隆至pUC57載體并命名為pUC57-PCV4。將含有pUC57-PCV4的菌液接種于6 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)11 h，按照質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 反應(yīng)條件優(yōu)化

以pUC57-PCV4質(zhì)粒為模板，利用方陣法對(duì)模板用量、引物濃度、退火延伸溫度及時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最適反應(yīng)條件。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

利用分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度，并將濃度換算成拷貝數(shù)，拷貝數(shù)＝[6.02×1014×濃度（ng/μL）]/（片段大小×660），獲得陽(yáng)性質(zhì)粒的拷貝數(shù)為5.64×1010copies/μL。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)蕴荻认♂尯蟮馁|(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。

1.6 敏感性檢測(cè)

利用ddH2O對(duì)重組質(zhì)粒pUC57-PCV4進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)謩e進(jìn)行普通PCR與qPCR擴(kuò)增，比較兩種方法檢測(cè)的最低拷貝數(shù)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。

1.7 特異性檢測(cè)

提取PCV1、PCV2、PCV3、PRRSV及PEDV陽(yáng)性樣品的基因組作為檢測(cè)模板，以重組質(zhì)粒pUC57-PCV4為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O為陰性對(duì)照。以1.4中優(yōu)化好的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，進(jìn)行特異性試驗(yàn)并分析。

1.8 重復(fù)性檢測(cè)

選取其中3個(gè)稀釋梯度（5.64×104～5.64×106copies/μL）的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為模板，分別進(jìn)行3次組內(nèi)與組間平行試驗(yàn)，比較組內(nèi)和組間的Ct值及變異系數(shù)。驗(yàn)證熒光定量PCR方法的重復(fù)性。

1.9 臨床樣品的檢測(cè)

將采集的56份豬臨床樣品根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA，利用本研究中建立的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化

通過(guò)方陣法對(duì)SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系：2×SYBR Green I Master Mix 10 μL，上下游引物各0.3 μL，DNA 1 μL，ddH2O 8.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

根據(jù)質(zhì)粒濃度計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)濃度為5.64×1010copies/μL，將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋后作為模板進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)?？截悢?shù)呈良好的線性關(guān)系（圖1），線性回歸方程為y=-3.638x+44.446，R2=0.999。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 熔解曲線

對(duì)不同拷貝數(shù)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖2）顯示，在82.3 ℃左右可見(jiàn)狹窄、單一的特異性熔解峰，熔解峰高度與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的濃度呈正相關(guān)。

圖2 熔解曲線

2.4 敏感性

用5.64×109～5.64×102copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別進(jìn)行普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3和圖4顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)下限為5.64×102copies/μL，而普通PCR的檢測(cè)下限為5.64×105copies/μL，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)PCV4的敏感性是普通PCR方法的1 000倍。

圖3 SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR敏感性分析結(jié)果

圖4 普通PCR敏感性分析結(jié)果

2.5 特異性試驗(yàn)

利用本研究建立的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，以PCV1、PCV2、PCV3、PRRSV及PEDV基因組DNA為模板，驗(yàn)證方法的特異性。結(jié)果（圖5）顯示，僅PCV4出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，而PCV1、PCV2、PCV3、PRRSV、PEDV及陰性對(duì)照均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。

圖5 特異性分析結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

以3個(gè)不同稀釋倍數(shù)（5.64×104～5.64×106copies/μL）的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，分別進(jìn)行3次組內(nèi)和組間的重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果（表1）顯示，組內(nèi)變異系數(shù)在0.08%～0.38%之間，組間變異系數(shù)在0.04%～0.08%之間，均小于2%，表明該方法具有較好的重復(fù)性，熒光定量PCR擴(kuò)增效率穩(wěn)定。

表1 SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品檢測(cè)

利用本研究中建立的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)56份豬臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果有2份樣品檢測(cè)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為3.57%（2/56）。其中，Ct值分別為30.148和19.935，拷貝數(shù)分別為8.5×103copies/μL和5.4×106copies/μL。將2份陽(yáng)性樣品擴(kuò)增產(chǎn)物回收后送公司測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與PCV4參考毒株HNU-AHG1-2019同源性為100%。使用普通PCR方法檢測(cè)上述56份豬臨床樣品，僅檢測(cè)到1份樣本為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為1.79%（1/56），且與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果一致。

3 討論

PCV是豬圓環(huán)病毒病的元兇。多項(xiàng)研究證實(shí)PCV主要誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致免疫抑制和耗竭，進(jìn)而促進(jìn)其他病原體的感染與增殖[7-9]。臨床上PCV主要引起PMWS和PDNS。此外，PNP（增生性壞死性肺炎）、PRDC（豬呼吸道疾病綜合征）、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病亦與PCV2感染有重要關(guān)聯(lián)[10]。近年來(lái)，PCV在全球多個(gè)國(guó)家暴發(fā)流行，而且流行范圍正不斷擴(kuò)大[11]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)多個(gè)省份豬場(chǎng)均檢測(cè)到PCV2和PCV3，且部分地區(qū)陽(yáng)性率高達(dá)80%以上，說(shuō)明PCV已經(jīng)在我國(guó)廣泛傳播[12]。此外，PCV2和PCV3均被證實(shí)能跨物種傳播[13-14]。2019，從我國(guó)湖南省有嚴(yán)重臨床癥狀的病豬樣本中檢測(cè)到一種新型PCV—PCV4。通過(guò)基因組比對(duì)分析，該病毒與PCV1、PCV2和PCV3的全基因組同源性僅為43.2%～51.5%，ORF2的核酸序列同源性僅為24.5%～45%，表明PCV4是一種與PCV1、PCV2和PCV3完全不同的新型PCV。隨后河南省和陜西省的豬場(chǎng)均檢測(cè)到該病毒[15]。流行病學(xué)調(diào)查表明PCV4可能與PCV2和PCV3相似，引起PMWS和PDNS。

PCV4作為一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，尚沒(méi)有成熟穩(wěn)定有效的檢測(cè)方法，急需一種敏感性好、特異性高的檢測(cè)方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR由于操作簡(jiǎn)單、適合大量樣本檢測(cè)，已經(jīng)逐漸在病原微生物檢測(cè)、臨床樣品檢測(cè)和基因研究等方面得到廣泛應(yīng)用。SYBR Green I作為常用的熒光染料，對(duì)雙鏈DNA具有高度專(zhuān)一性，且對(duì)引物設(shè)計(jì)要求一般，成本低且操作簡(jiǎn)便。SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法已經(jīng)在PCV2和PCV3檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用和驗(yàn)證。本試驗(yàn)根據(jù)NCBI上已公布的PCV4的Rep基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板建立一種針對(duì)PCV4的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。本試驗(yàn)建立的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)品與Ct值在5.64×102～5.64×109copies/μL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，R2為0.999，檢測(cè)下限為5.64×102copies/μL。郭慧娟等[16]建立的針對(duì)PCV2的熒光定量PCR方法檢測(cè)下限為6.84×102copies/μL，李卓昕[17]建立的針對(duì)PCV3的熒光定量檢測(cè)方法檢測(cè)下限為4.24×101copies/μL。以上結(jié)果表明本研究建立的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法靈敏度能夠滿足臨床檢測(cè)需要。利用該方法檢測(cè)PCV1、PCV2和PCV3均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，特異性熔解峰均在82.3 ℃，組間和組內(nèi)的變異系數(shù)均小于2%，表明本研究建立的方法重復(fù)性好。利用本研究建立的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)56份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為3.57%（2/56），檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相符，而普通PCR檢出率僅為1.78%，說(shuō)明本研究建立的熒光定量方法更加靈敏可靠，更加適用于臨床檢測(cè)。

綜上所述，本研究建立了一個(gè)快速、靈敏、特異的PCV4 SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，能初步滿足其臨床快速診斷需要。