豬瘟病毒C株檢測(cè)用國(guó)家核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

王英超，高曉龍，梅 力，高 敏，宋彥軍，韋海濤，趙啟祖，李 翠，馮小宇

（1.北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600；2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100190）

豬瘟（classical swine fever，CSF）又稱(chēng)爛腸瘟，是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的一種高致死性傳染病。該病表現(xiàn)為接觸性傳染，以急性、敗血性變化，實(shí)質(zhì)器官出血、壞死和梗死，以及慢性呈纖維素性壞死性腸炎為主要特征。CSF是嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報(bào)動(dòng)物疫病[1]，也是我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的一類(lèi)動(dòng)物疫病[2]。近年來(lái)我國(guó)流行的CSF以非典型性臨床癥狀和病理剖檢特征為主[3]。目前CSF病原學(xué)檢測(cè)方法主要是熒光定量RT-PCR[4]，此外新興的檢測(cè)技術(shù)，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）也逐漸應(yīng)用于CSFV檢測(cè)領(lǐng)域[5]。但是現(xiàn)有的檢測(cè)試劑種類(lèi)繁多，檢測(cè)靈敏度參差不齊，對(duì)結(jié)果的判定存在較大的誤差和爭(zhēng)議。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（reference material，RM）是具有一種或多種足夠均勻且確定特性值的物質(zhì)或材料，廣泛用于校準(zhǔn)、測(cè)試儀器，評(píng)價(jià)和控制測(cè)試方法，實(shí)驗(yàn)室量值傳遞、材料賦值，質(zhì)量檢定、質(zhì)量控制，質(zhì)量仲裁，生產(chǎn)過(guò)程檢測(cè)等領(lǐng)域[6]。我國(guó)在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，特別是對(duì)于動(dòng)物病原微生物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究相對(duì)滯后。因此，本研究制備CSFV核酸檢測(cè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以期為檢測(cè)試劑可靠驗(yàn)證、實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定及精準(zhǔn)化疫病防控提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

CSFV C株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；PK-15細(xì)胞，由北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM低糖培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司；凍干保護(hù)劑5%蔗糖牛奶，購(gòu)自北京中海生物科技有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，購(gòu)自西安天隆科技有限公司；One-Step RT-ddPCR Kit for Probes、Droplet Generation for Probes，均購(gòu)自伯樂(lè)公司；引物、探針，由英濰捷基有限公司合成。

1.2 主要設(shè)備

天隆科技自動(dòng)化核酸提取儀，購(gòu)自西安天隆科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、QX100 Droplet Generator、PX1 Plate Sealer、QX100 Droplet Reader，均購(gòu)自伯樂(lè)（Bio-Rad）公司；普通PCR儀，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；FDU-1200型凍干機(jī)，購(gòu)自東京理化器械株式會(huì)社；104/02型電子天平，購(gòu)自METTLER TOLEDO公司。

1.3 候選物篩選與鑒定

豬瘟兔化弱毒疫苗（C株）是由我國(guó)石門(mén)強(qiáng)毒株（屬于1.1基因亞型）通過(guò)兔體內(nèi)連續(xù)傳代致弱而來(lái)，對(duì)我國(guó)的CSF防控具有重要作用，也是世界公認(rèn)具有良好免疫效果的弱毒疫苗，因此選用CSFV C株制備CSFV核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。通過(guò)測(cè)序及序列比對(duì)，鑒定購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的CSFV C株。

1.4 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

培養(yǎng)PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)至70%以上的單層時(shí)，棄去培養(yǎng)液，按培養(yǎng)液體積的10%接種經(jīng)過(guò)鑒定的CSFV C株，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞作為陰性對(duì)照。接種完后，將細(xì)胞置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育3 h，回收病毒液，補(bǔ)加含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液，再置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h。收獲病毒液，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。56 ℃水浴4 h滅活，將病毒培養(yǎng)液與凍干保護(hù)劑按1:1的比例等體積混勻，每瓶1 mL分裝于凍干瓶?jī)?nèi)。分裝后放入超低溫冰箱內(nèi)預(yù)凍24 h，按照EYELA FDU-1200凍干機(jī)操作說(shuō)明進(jìn)行凍干后保存于（-20±5）℃環(huán)境中。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢驗(yàn)

1.5.1 物理性狀檢驗(yàn) 對(duì)凍干后的CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)開(kāi)展物理性狀檢驗(yàn)，應(yīng)呈白色均一粉末。

1.5.2 病毒滅活檢驗(yàn) 將CSFV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶解后接種于PK-15細(xì)胞，每天觀察細(xì)胞病變，連續(xù)觀察3～7 d，無(wú)論有無(wú)細(xì)胞病變，一律將培養(yǎng)物收獲，凍融后再進(jìn)行傳代，每個(gè)樣品至少盲傳3代，盲傳3代后，觀察各代次細(xì)胞，并通過(guò)CSFV熒光定量RT-PCR方法對(duì)各代次細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.3 支原體檢驗(yàn) 通過(guò)支原體培養(yǎng)方式檢測(cè)制備的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是否存在支原體污染。

1.5.4 其他病毒檢驗(yàn) 對(duì)豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒美洲變異株（PRRSV JXA1）、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒歐洲株（PRRSV LV）、豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）共八種其他病毒，依據(jù)國(guó)標(biāo)等標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.5.5 水分檢驗(yàn) 依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版一部附錄，按照其規(guī)程操作，進(jìn)行水分測(cè)定[7]。

1.6 均勻性評(píng)估

根據(jù)我國(guó)《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》（JJF1343—2012）[8]規(guī)定，當(dāng)總體單元少于500時(shí)，抽取單元數(shù)不少于15個(gè)；當(dāng)總體單元數(shù)大于500時(shí)，抽取單元數(shù)不少于25個(gè)。本批CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)共制備了300瓶，隨機(jī)選取15瓶，每瓶取樣3次。采用數(shù)字PCR方法對(duì)核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的核酸含量進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用方差分析法（F檢驗(yàn)）進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。

1.7 穩(wěn)定性評(píng)估

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性是衡量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的一個(gè)重要參數(shù)，包括短期穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性。短期穩(wěn)定性與樣品運(yùn)輸過(guò)程中的外部因素有關(guān)，長(zhǎng)期穩(wěn)定性與貯存條件有關(guān)。

1.7.1 短期穩(wěn)定性評(píng)估 隨機(jī)抽取一定量的CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并做好標(biāo)記，分別放置于4、25、60 ℃的環(huán)境中。每周定期抽取3管CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每管樣品重復(fù)檢測(cè)3次。采用數(shù)字PCR方法檢測(cè)，通過(guò)SPSS 23.0軟件利用T檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，P＜0.05表示差異顯著。

1.7.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估 隨機(jī)抽取一定量的CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并做好標(biāo)記，放置于（-20±2）℃（本品貯存條件）的環(huán)境中數(shù)月，分別在第0、1、2、4、6、8、11個(gè)月，每次抽取3管CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每管樣品重復(fù)檢測(cè)3次，采用數(shù)字PCR進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算均值，并利用線性回歸方法分析數(shù)據(jù)。

1.8 開(kāi)瓶穩(wěn)定性評(píng)估

抽取CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)3管，每管進(jìn)行5次開(kāi)瓶檢測(cè)，每次檢測(cè)后需蓋緊管蓋，置于自封袋中密封，于-20 ℃保存。再次稱(chēng)量前，需60 ℃烘干瓶壁水分，再做后續(xù)檢測(cè)。每管樣品重復(fù)檢測(cè)3次，以第1次開(kāi)瓶的檢測(cè)數(shù)據(jù)為對(duì)照組，采用數(shù)字PCR進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算均值。通過(guò)SPSS 23.0軟件利用T檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，P＜0.05表示差異顯著。

1.9 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值

通過(guò)具備資質(zhì)的8家實(shí)驗(yàn)室（表1）獨(dú)立使用數(shù)字PCR方法對(duì)CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值進(jìn)行測(cè)量，獲得定值數(shù)據(jù)。采用狄克遜法和格拉布朗法分別檢驗(yàn)8家實(shí)驗(yàn)室8組數(shù)據(jù)的可疑值。采用科克倫法檢驗(yàn)平均值間是否等精度，通過(guò)SPSS 23.0軟件，利用T檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。若各組測(cè)量數(shù)據(jù)是等精度數(shù)據(jù)，并且組間平均值無(wú)顯著性差異（P＞0.05），則標(biāo)準(zhǔn)值可用各組數(shù)據(jù)算術(shù)平均值的平均值除以核酸回收率來(lái)表示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)合作測(cè)試實(shí)驗(yàn)室

1.10 不確定度評(píng)定

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的不確定度包括3部分：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值過(guò)程帶來(lái)的不確定度。其中，定值不確定度包括不確定度A類(lèi)評(píng)定和不確定度B類(lèi)評(píng)定。不確定度A類(lèi)評(píng)定，對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測(cè)量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算方法進(jìn)行；不確定度B類(lèi)評(píng)定包含四部分：第一部分是天平稱(chēng)量引入的不確定度，第二部分是稀釋引入的不確定度，第三部分是檢測(cè)儀器引入的不確定度，第四部分是核酸回收率引入的不確定度。

將定值相對(duì)不確定度與均勻性相對(duì)不確定度、穩(wěn)定性相對(duì)不確定度，按照平方和開(kāi)方的方法疊加獲得相對(duì)不確定度，即合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的相對(duì)值，記為uCRM。該相對(duì)不確定度乘以因子（該因子稱(chēng)為包含因子，記為k），再乘以標(biāo)準(zhǔn)值，得出的不確定度稱(chēng)為擴(kuò)展不確定度或稱(chēng)總不確定度，記為U。

1.11 量值結(jié)果表示

CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值（copies/mg）=標(biāo)準(zhǔn)值±擴(kuò)展不確定度。

1.12 臨床試用

通過(guò)3家不同實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的產(chǎn)品性能，主要測(cè)試產(chǎn)品的均勻性、量值的準(zhǔn)確性、產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。隨機(jī)抽取核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各5管，低溫保存運(yùn)送至試用單位進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。試用單位在檢測(cè)日常臨床樣本時(shí)，將試用的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（取樣量不少于50 μL）和臨床樣本同時(shí)進(jìn)行核酸提取后，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑的說(shuō)明書(shū)將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和臨床樣本一同進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，每次檢測(cè)1管標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每管重復(fù)檢測(cè)2次。

2 結(jié)果

2.1 候選物鑒定

購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的CSFV C株與GenBank編號(hào)Z46258.1的CSFV C株核苷酸相似度為100%（圖1）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

分裝凍干，壓蓋后獲得CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

圖1 CSFV基因測(cè)序及序列比對(duì)結(jié)果

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢驗(yàn)

2.3.1 物理性狀檢驗(yàn) CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)呈白色均一粉末（圖2）。

圖2 CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)物理性狀

2.3.2 病毒滅活試驗(yàn) 未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞病變且經(jīng)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，CSFV核酸含量不隨培養(yǎng)物代次增加而增加，說(shuō)明無(wú)病毒增殖。

2.3.3 支原體檢驗(yàn) 支原體檢測(cè)為陰性，說(shuō)明核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)未受支原體污染。

2.3.4 其他病毒檢驗(yàn) 依據(jù)國(guó)標(biāo)等標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，對(duì)PRRSV JXA1、PRRSV LV、PCV1、PCV2、PRV、PPV、PEDV和TGEV共8種其他病毒進(jìn)行檢驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性（表2）。

表2 其他病毒檢驗(yàn)

2.3.5 水分檢驗(yàn) 依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版一部附錄，按照其規(guī)程操作，進(jìn)行水分測(cè)定，本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含水量均不高于3.0%，符合《獸醫(yī)檢測(cè)用核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)規(guī)范》要求。

2.4 均勻性評(píng)估

根據(jù)隨機(jī)抽取的15瓶CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)每瓶檢測(cè)3次的數(shù)據(jù)（表3）、自由度及給定的顯著性水平α，由表查詢(xún)臨界值的Fα值，算得F＜Fα（F(0.05，14，30)=2.04），表明組內(nèi)與組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），樣品是均勻的（表4）。

表3 CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)核酸含量檢測(cè)結(jié)果 單位：copies/mg

表4 CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性方差分析

2.5 穩(wěn)定性評(píng)估

2.5.1 短期穩(wěn)定性評(píng)估 CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在4、25和60 ℃環(huán)境中放置數(shù)周，分別與放置在-80 ℃的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果的P值與0.05比較。表5顯示，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在4 ℃下可穩(wěn)定存放4周，在25 ℃可穩(wěn)定存放1周，無(wú)法存放于60 ℃環(huán)境中。

表5 短期穩(wěn)定性評(píng)估結(jié)果

2.5.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估 對(duì)CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20 ℃貯存條件下穩(wěn)定性結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析。第11個(gè)月|β1|/s（β1）的結(jié)果為1.40，小于對(duì)應(yīng)的T（0.05，5）臨界值為（2.57），認(rèn)為斜率無(wú)顯著性差異（P＞0.05），未觀測(cè)到不穩(wěn)定性；第12個(gè)月|β1|/s（β1）的結(jié)果為4.73，大于對(duì)應(yīng)的T（0.05，5）臨界值（2.57），認(rèn)為斜率存在顯著性差異（P＜0.05）。故本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20 ℃環(huán)境下可穩(wěn)定11個(gè)月。

2.6 開(kāi)瓶穩(wěn)定性評(píng)估

隨機(jī)抽取3瓶CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行第1～5次開(kāi)瓶檢測(cè)，然后將第2～5次的檢測(cè)結(jié)果，分別與第1次進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)。結(jié)果（表6）顯示，均顯示無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表6 開(kāi)瓶穩(wěn)定性t檢驗(yàn)結(jié)果

2.7 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值

由8家合作定值實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，各組測(cè)量數(shù)據(jù)是等精度數(shù)據(jù)，并且組間平均值無(wú)顯著性差異，故此，測(cè)量結(jié)果可用算術(shù)平均值表示。

標(biāo)準(zhǔn)值=算術(shù)平均值/核酸回收率，其中算數(shù)平均值為469 457 copies/mg，核酸回收率為92%，故標(biāo)準(zhǔn)值為5.1×105copies/mg。

2.8 不確定度評(píng)定

2.8.1 均勻性引入的不確定度 CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性產(chǎn)生的不確定度即為測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度（ubb）=（CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差Sbb）/（CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性測(cè)量結(jié)果的平均值）。

2.8.2 穩(wěn)定性引入的不確定度 穩(wěn)定性引入的不確定度由CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)-20 ℃儲(chǔ)存11個(gè)月的長(zhǎng)期穩(wěn)定性產(chǎn)生的不確定度來(lái)計(jì)算。

2.8.3 定值過(guò)程引入的不確定度 不確定度A類(lèi)評(píng)定通過(guò)測(cè)量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測(cè)量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算方法進(jìn)行。

CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度B類(lèi)評(píng)定包含天平稱(chēng)量引入的不確定度、稀釋引入的不確定度、檢測(cè)儀器引入的不確定度以及核酸回收率帶來(lái)的不確定度。

2.8.4 相對(duì)不確定度 定值相對(duì)不確定度與均勻性相對(duì)不確定度、穩(wěn)定性相對(duì)不確定度按照平方和開(kāi)方的方法疊加獲得相對(duì)不確定度，即合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的相對(duì)值。

2.8.5 擴(kuò)展不確定度評(píng)定 相對(duì)不確定度乘以包含因子（取包含因子k=2），再乘以標(biāo)準(zhǔn)值，即為擴(kuò)展不確定度，記為U。

2.9 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值

CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值為（5.1±0.7）×105copies/mg。

2.10 臨床試用

3家試用單位檢測(cè)CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的CT值均處于18～22之間，且CV值均小于10%（表7）。試驗(yàn)結(jié)果顯示，該產(chǎn)品均一性良好、量值的準(zhǔn)確度高、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，與臨床樣本的互通性良好。

表7 CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)試用結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，國(guó)際學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)不斷提出“檢驗(yàn)結(jié)果一致化”的概念和相關(guān)技術(shù)途徑[9]，通過(guò)可溯源至SI單位的參考物質(zhì)確保臨床檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性。目前，我國(guó)也將病原微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提上日程，通過(guò)國(guó)家一級(jí)、二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行溯源。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值方式也由通過(guò)傳統(tǒng)的熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行相對(duì)定量轉(zhuǎn)變成利用新興的微滴式數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量。

微滴式數(shù)字PCR技術(shù)[10]是一種新興的利用絕對(duì)定量方式檢測(cè)核酸的技術(shù)。其技術(shù)原理是利用數(shù)字PCR系統(tǒng)核心的微滴化技術(shù)將一份樣品分成多個(gè)反應(yīng)的微滴，每個(gè)微滴對(duì)應(yīng)1個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)單元，在PCR擴(kuò)增結(jié)束后存在熒光信號(hào)（產(chǎn)物）記為1，沒(méi)有熒光信號(hào)（產(chǎn)物）記為0。本質(zhì)上將傳統(tǒng)熒光定量PCR的1個(gè)反應(yīng)變成多個(gè)獨(dú)立反應(yīng)，大大提高了核酸序列檢測(cè)的靈敏度和精準(zhǔn)度。

本研究采用微滴式數(shù)字PCR進(jìn)行絕對(duì)定值，同時(shí)嚴(yán)格按照《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》（JJF1343－2012）規(guī)定，對(duì)研究制備的CSFV C株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性評(píng)估、穩(wěn)定性考察、合作定值、不確定度評(píng)定，最終該核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過(guò)了全國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會(huì)的評(píng)審并獲得國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)[證字第2015 GBW（E）091014]。有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以市場(chǎng)流通銷(xiāo)售，滿足了動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)領(lǐng)域?qū)?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的需求，可用于實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證、儀器校準(zhǔn)和測(cè)試、檢測(cè)方法評(píng)價(jià)和控制、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制、生產(chǎn)過(guò)程檢測(cè)等領(lǐng)域，有利于大幅提升疫病監(jiān)測(cè)、診斷的效率及準(zhǔn)確性，有效保障CSF防治工作的開(kāi)展，推進(jìn)CSFV核酸分子檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化及我國(guó)CSFV體外診斷試劑[11]的量值溯源和檢測(cè)結(jié)果一致化。

綜上，本研究通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)CSFV，添加適量的穩(wěn)定劑和保護(hù)劑凍干保存，獲得CSFV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。采用數(shù)字PCR方法，由多家實(shí)驗(yàn)室合作定值，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值和評(píng)定不確定度。本研究研制的CSFV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過(guò)了全國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會(huì)的評(píng)定，均一性良好、穩(wěn)定、量值準(zhǔn)確度高，可用于動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)。