一起鸚鵡多重混合感染的診治

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109）

鸚鵡喙羽病是由喙羽病病毒（psittacine beak and feather disease virus，PBFDV）引起的一種常見(jiàn)的鸚鵡傳染病，患病鸚鵡羽毛、喙部變形，胸腺及法氏囊結(jié)構(gòu)異常，通常造成幼雛死亡[1]，可垂直傳播；按病程長(zhǎng)短可分為急性型、慢性型和亞臨床型，急性型常發(fā)生于幼雛，患病鸚鵡突然死亡[2]，慢性型和亞臨床型常發(fā)生于成年鸚鵡，導(dǎo)致羽毛、喙和爪子畸形[3]。喙羽病于20世紀(jì)70年代在澳大利亞首次被發(fā)現(xiàn)，之后隨著活禽貿(mào)易而蔓延至全球[4]。PBFDV屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus）成員，為單鏈環(huán)形DNA病毒[5]，基因組大小為2 000 bp，編碼復(fù)制相關(guān)蛋白（replication-associated protein，Rep）和衣殼蛋白（capsid protein，Cap）2 個(gè)主要蛋白[2，5]。電鏡觀察病毒呈14～16 nm無(wú)包膜二十面體[6]。鸚鵡幼雛?。╞udgerigar fledgling disease，BFD）是由禽多瘤病毒（avian polyomavirus，APV）引起的急性傳染病，是目前對(duì)鸚鵡危害最為嚴(yán)重的傳染病之一[7]，3周齡以下的鸚鵡雛鳥(niǎo)易感，表現(xiàn)為羽毛發(fā)育遲緩、消瘦、腹部腫脹和神經(jīng)癥狀等，致死率極高。BFD于1980年初首先在美國(guó)被發(fā)現(xiàn)，隨后在澳大利亞、日本、意大利、匈牙利、斯洛伐克和德國(guó)等被陸續(xù)報(bào)道，現(xiàn)已蔓延至世界各地[8]。我國(guó)于1994年首次在湖北省發(fā)現(xiàn)該病，并確認(rèn)該病由APV引起[9]。APV為乳多空病毒科（Polyomaviridae）多瘤病毒屬（Polyomavirus）成員，為無(wú)囊膜、環(huán)形雙鏈 DNA[10]，基因組大小為4 981 bp，編碼Large T、Small t、VP1、VP2、VP3、VP4 和 VP4 Delta 等7種蛋白[11]。

鸚鵡作為一種觀賞鳥(niǎo)類，越來(lái)越受人們的喜愛(ài)，因而鸚鵡養(yǎng)殖業(yè)隨之興起。隨著鸚鵡養(yǎng)殖業(yè)的擴(kuò)大和進(jìn)口量的增加，疾病也越來(lái)越多。PBFDV和APV是感染鸚鵡的常見(jiàn)病毒，嚴(yán)重危害鸚鵡的健康，對(duì)鸚鵡養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大影響，導(dǎo)致嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。2019年12月山東省青島市某虎皮鸚鵡養(yǎng)殖場(chǎng)2～3周齡幼鳥(niǎo)出現(xiàn)腹瀉、脫水、腹部腫大，嗉囊飽滿，排白綠色糞便，糞便糊肛，發(fā)育遲緩等臨床癥狀，大量鸚鵡幼雛死亡，死亡率達(dá)到80%。成鳥(niǎo)無(wú)死亡，無(wú)明顯發(fā)病癥狀，產(chǎn)蛋正常。該場(chǎng)鸚鵡未接種過(guò)任何疫苗，發(fā)病后曾用恩諾沙星、土霉素、雙黃連等藥物進(jìn)行治療。本研究對(duì)該養(yǎng)殖場(chǎng)的患病幼鳥(niǎo)進(jìn)行了臨床診斷，使用PCR方法進(jìn)行了相關(guān)病毒檢測(cè)，無(wú)菌采集發(fā)病幼鳥(niǎo)組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定等細(xì)菌學(xué)檢測(cè)，確診為PBFDV、APV及鏈球菌混合感染，并提出相應(yīng)的治療措施。

1 材料與方法

1.1 病理剖檢及病料采集

對(duì)送檢的死亡和發(fā)病的10～15日齡的虎皮鸚鵡幼鳥(niǎo)進(jìn)行病理剖檢觀察，無(wú)菌采集發(fā)病鸚鵡的肝臟、肺臟及心包積液進(jìn)行病原檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)

1.2.1 主要試劑 TSA、TSB培養(yǎng)基及革蘭氏染色液，均購(gòu)自青島海博生物有限公司；MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒，購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司（TaKaRa）；一步法PCR試劑盒（Dye Plus），購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司；禽腺病毒及鸚鵡熱衣原體熒光定量PCR試劑盒，購(gòu)自青島巴特菲生物科技有限公司；細(xì)菌核酸提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2.2 PCR檢測(cè) 根據(jù)參考文獻(xiàn)合成PBFDV、APV、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）引物，由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成（表1）。無(wú)菌采集適量發(fā)病鸚鵡的肝、肺組織研磨后取上清，使用病毒核酸提取試劑盒提取上清液中的病毒核酸（DNA/RNA）采用普通PCR方法檢測(cè)PBFDV、APV、NDV及AIV用熒光定量試劑盒檢測(cè)禽腺病毒和衣原體。

表1 PCR檢測(cè)引物

1.2.3 細(xì)菌分離鑒定 無(wú)菌采集鸚鵡肝臟及心包積液，劃線接種于TSA培養(yǎng)基及血瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h。挑取單個(gè)純菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。取分離得到的單個(gè)菌落接種到肉湯試管中培養(yǎng)增菌，過(guò)夜培養(yǎng)菌液，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，利用通用引物[15]擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，PCR產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，所得序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 操作程序參考李桂喜等[16]試驗(yàn)方法。采用紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行阿莫西林克拉維酸、強(qiáng)力霉素、頭孢他啶、頭孢曲松、妥布霉素、大觀霉素、慶大霉素、多粘菌素B、林可霉素、左氧沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、磺胺甲惡唑等藥物的藥敏試驗(yàn)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)美國(guó)NCCLS藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)判定藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理剖檢

剖檢發(fā)現(xiàn)：肝臟表面有大小不等的黃白色壞死灶，呈大理石樣外觀（圖1-A）；心包積液，心肌出血；腹腔積液呈黃色，有膠凍樣滲出（圖1-B）；十二指腸出血（圖1-C），肌胃出血；肺出血，氣管環(huán)出血（圖1-D），輸尿管有白色尿酸鹽沉積，脾臟腫大。

圖1 病理剖檢結(jié)果

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

2.2.1 PCR檢測(cè) 對(duì)提取的核酸進(jìn)行PCR、RTPCR以及熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果NDV、AIV、禽腺病毒、衣原體均為陰性。PBFDV、APV的PCR擴(kuò)增目的條帶與預(yù)期大小一致，分別為495 bp、318 bp，PBFDV在肝組織檢測(cè)為陽(yáng)性，肺組織為陰性；APV在肝、肺組織均檢測(cè)為陽(yáng)性（圖2）。

圖2 PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 細(xì)菌分離鑒定 TSA培養(yǎng)基上出現(xiàn)半透明、圓形、表面光滑、整齊的菌落（圖3-A），血瓊脂平板上出現(xiàn)不同程度的溶血（圖3-B），革蘭氏染色陽(yáng)性，呈單個(gè)或雙鏈排列，有些呈短鏈狀排列（圖3-C）。對(duì)提取的細(xì)菌核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1 428 bp的目的條帶（圖4），與預(yù)期片段大小相符。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)分析確定該分離菌株為鏈球菌。

圖3 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

圖4 16sDNA PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2.3 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，該分離菌對(duì)阿莫西林克拉維酸高度敏感，強(qiáng)力霉素中度敏感，而對(duì)頭孢他啶、頭孢曲松、妥布霉素、大觀霉素、慶大霉素、多粘菌素B、林可霉素、左氧沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、磺胺甲惡唑不敏感。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 防治

PBFDV和BFD目前尚無(wú)有效的治療藥物和疫苗。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)鏈球菌進(jìn)行抗菌治療，建議該場(chǎng)鸚鵡使用阿莫西林克拉維酸飲水5 d。同時(shí)建議鸚鵡養(yǎng)殖場(chǎng)的主人做好，嚴(yán)格消毒；保持鳥(niǎo)舍良好的環(huán)境衛(wèi)生和豐富的營(yíng)養(yǎng)飼料，飼料或飲水中加入適量的維生素、微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分，以提高免疫力。及時(shí)淘汰病鳥(niǎo)，防止疾病的傳播和蔓延。場(chǎng)長(zhǎng)反饋用藥5 d后死亡率有所下降。

4 討論

PBFD和BFD是鸚鵡的常見(jiàn)傳染病，在鸚鵡養(yǎng)殖中較為多發(fā)，危害嚴(yán)重，對(duì)幼雛影響較大，致死率較高，成年鸚鵡無(wú)明顯的臨床癥狀，這為養(yǎng)殖場(chǎng)的疾病預(yù)防工作造成了極大影響。本研究針對(duì)青島市某鸚鵡養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)病情況進(jìn)行了相關(guān)病毒PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示PBFDV和APV呈陽(yáng)性，排除了流感病毒、新城疫病毒、腺病毒以及衣原體的感染，并分離鑒定出鏈球菌，確診該病例為PBFDV、APV及鏈球菌混合感染。PBFDV和APV感染鸚鵡的研究早已被多次報(bào)道，曾有研究者證明，1994年BFD在我國(guó)已經(jīng)開(kāi)始傳播，并證明病原為APV[9]。APV引起B(yǎng)FD的病例被發(fā)現(xiàn)的時(shí)間較早，但始終沒(méi)有引起人們重視。PBFD于20世紀(jì)70年代在澳大利亞首次被發(fā)現(xiàn)，之后隨著活禽貿(mào)易而蔓延至全球[4]。蔣文明等[12]在2009年首次報(bào)道了PBFDV在我國(guó)大陸地區(qū)鸚鵡種群的傳播，后PBFDV也陸續(xù)在我國(guó)養(yǎng)殖場(chǎng)中檢出，但始終沒(méi)有引起人們的重視。Fogell等[17]在8個(gè)沒(méi)有報(bào)道過(guò)PBFDV的國(guó)家中檢測(cè)出PBFDV，表明該病毒的分布比目前所掌握的更廣泛。有研究發(fā)現(xiàn)，活禽貿(mào)易是PBFDV傳播的重要方式[18]。因此，需要加強(qiáng)鸚鵡疾病的檢測(cè)與防控工作，以及進(jìn)口鸚鵡的防疫檢測(cè)，建立合理有效的鸚鵡病檢疫程序，以保證鸚鵡養(yǎng)殖業(yè)的平穩(wěn)發(fā)展。PBFDV和APV混合感染的情況比較多見(jiàn)，而且PBFD和BFD癥狀相似，在診斷時(shí)要做到準(zhǔn)確診斷，做好鑒別區(qū)分，如1998年Ramis等[19]首次在鸚鵡養(yǎng)殖舍中發(fā)現(xiàn)PBFDV和APV的混合感染，吳汝娟等[20]對(duì)青島市的發(fā)病鸚鵡進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)存在PBFDV和APV的雙重感染。在疾病過(guò)程中常常繼發(fā)細(xì)菌感染，因此對(duì)致病菌的檢測(cè)必不可少。本研究在患病鸚鵡的肝臟組織中分離鑒定出鏈球菌。鏈球菌為條件性致病菌，通常在一定誘因的作用下才會(huì)發(fā)病。本研究推斷，該養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病的原因可能是由于冬季溫度降低，舍內(nèi)通風(fēng)不良，導(dǎo)致PBFD、BFD及鏈球菌的混合感染。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)阿莫西林克拉維酸高度敏感，而對(duì)頭孢他啶等多種藥物均耐藥，所以臨床使用抗生素一定要選用敏感藥物，切忌亂用藥，以免造成更大的損失。

近年來(lái)，我國(guó)引進(jìn)大量鸚鵡，造成外來(lái)鸚鵡疾病的傳播，但對(duì)于鸚鵡疾病的研究卻很少。由于對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)不足以及不夠重視，導(dǎo)致許多疾病的防疫工作難以進(jìn)行，治療也無(wú)計(jì)可施。希望本研究能引起廣大鸚鵡養(yǎng)殖戶的重視，也為PBFD和PFD的防治提供一定的參考。