牛巴貝斯蟲TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立

（甘肅省民勤縣畜牧獸醫(yī)工作站，甘肅民勤 733000）

巴貝斯蟲?。╞abesiosis），又名蜱熱和德克薩斯熱，硬蜱是其傳播媒介，是一種危害家畜健康的重要血液原蟲病之一，主要引起發(fā)病牛高熱、貧血、黃疸、可視黏膜出血，后期多出現(xiàn)血紅蛋白尿，嚴(yán)重時導(dǎo)致病畜死亡[1]。該病廣泛流行于世界各地，全球年防控經(jīng)費(fèi)高達(dá)30億美元[2]。目前我國已報道的牛巴貝斯蟲病有6種，涉及的病原有牛巴貝斯蟲（B.bovis）、雙芽巴貝斯蟲（B.bigemina）、大巴貝斯蟲（B.major）、卵形巴貝斯蟲（B.ovata）、巴貝斯蟲未定種（B.U.sp.Kashi）[3]，以及由劉鐘靈等發(fā)現(xiàn)感染水牛的東方巴貝斯蟲（B.orientalis）[4]。不同的巴貝斯蟲種引起的巴貝斯蟲病的分布范圍不盡相同，但主要流行于媒介蜱分布的熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，呈世界性分布，各大洲都有發(fā)生。我國各省份都有該病發(fā)生和分布的報道，如西藏、河北、河南、福建、云南、貴州、安徽、湖北、甘肅、廣東、廣西、江蘇、陜西等省份都有牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲的報道；大巴貝斯蟲主要分布于新疆；卵形巴貝斯蟲分布在河南、遼寧、甘肅、四川、貴州和吉林等省份[5]。其中牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲致病性最強(qiáng)，擁有相同的傳播媒介——微小牛蜱[6]。

牛巴貝斯蟲的傳統(tǒng)鑒定方法主要是在實(shí)驗(yàn)室條件下借助顯微鏡進(jìn)行蟲體的形態(tài)學(xué)觀察[7]。由于同屬病原的形態(tài)相似，在涂片制作、染色過程中容易造成鑒定蟲體變形，有時很難區(qū)分蟲體的屬和分離株。以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）為代表的血清學(xué)檢測方法只能對家畜血清抗體進(jìn)行檢測，不能反映宿主的實(shí)時感染現(xiàn)狀，也不適用于在媒介蜱體內(nèi)進(jìn)行巴貝斯蟲感染情況的流行病學(xué)調(diào)查和檢測[8]。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[9-15]為代表的分子生物學(xué)檢測方法，具有操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，尤其是實(shí)時熒光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）可實(shí)現(xiàn)快速檢測，為巴貝斯蟲病的分類鑒別提供了新思路。

本試驗(yàn)以巴貝斯蟲Rap-1a基因?yàn)榘谢?，建立牛巴貝斯蟲的TaqMan熒光定量PCR檢測方法。該方法具有敏感、特異、快速、簡便等特點(diǎn)，適用于牛巴貝斯蟲的診斷，可為該病流行病學(xué)調(diào)查提供快速有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和菌株及主要儀器

Premix ExTaqTM、ROX Reference Dye Ⅱ（50×）、PremixTaq?預(yù)混酶、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（DH5α），均購自TaKaRa公司；DNA提取試劑盒購，購自QIAGEN公司；ZymocleanGel DNA Recovery Kit瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；pGEM-T Easy載體，為Promega公司產(chǎn)品；Stratagene Mx 3005P熒光定量PCR儀，為美國Stratagene公司產(chǎn)品；NanoDrop 2000/200C超微量分光光度計(jì)，購自美國Thermo Scietific公司。

1.2 基因組

牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、大巴貝斯蟲、卵形巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲、中華泰勒蟲、牛無漿體陽性基因組，以及健康牛陰性對照基因組，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所外寄生蟲與蟲媒疫病團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室制備和保存。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中牛巴貝斯蟲Rap-1a基因的核苷酸序列（KT312814），用Primer Primer 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)TaqMan熒光定量PCR引物。上游引物B.bo-rap-1F：5'-GTTCCTTAGGGAGGTTCCTCATGCT-3'；下游引物B.bo-rap-1R：5'-AGTCGTTAGCCTGAGTGGTATTTTC-3'；探針Bbo-rap-rtPb：5'-AACATTGCTCAACCTGCCAAG-3'，探針5'標(biāo)記FAM熒光集團(tuán)，3'標(biāo)記BHQ1淬滅熒光集團(tuán)。引物和探針均由西安擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 常規(guī)PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)為25 μL體系：PremixTaq?預(yù)混酶（2×）12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)條件經(jīng)優(yōu)化為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，52.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析（含Goldview I 型核酸染色劑，8 μL/100 mL），觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒制備

將普通PCR擴(kuò)增條帶進(jìn)行膠回收，所得目的片段與pGEM-T Easy載體連接，連接體系為2×T4 DNA連接緩沖液5 μL、目的片段3 μL、載體1 μL、T4 DNA連接酶1 μL，共10 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽性菌落，將PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送西安擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。參考文獻(xiàn)[16]制備標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，使用EASY Dilution質(zhì)粒稀釋液將構(gòu)建的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行十倍比稀釋，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

應(yīng)用矩陣法對實(shí)時熒光定量PCR的上下游引物濃度、探針濃度、退火反應(yīng)溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)為25 μL體系，含Premix ExTaqTM（2×）12.5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.5 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）分別為0.2、0.5、0.8、1.0 μL，探針（10 μmol/L）分別為0.5、1.0 μL，水補(bǔ)齊至25 μL。退火溫度分別為54、56、58、60 ℃選擇，以得到最佳的反應(yīng)條件。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

將終濃度為1.0×108～1.0×101copies/μL的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，每個濃度重復(fù)3次，進(jìn)行TaqMan實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增，由儀器自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增方程式。

1.8 敏感性試驗(yàn)

將終濃度為1.0×108～1.0×102copies/μL的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，每個濃度重復(fù)3次，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，同時進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，比較其靈敏度。

1.9 特異性試驗(yàn)

以雙芽巴貝斯蟲、大巴貝斯蟲、卵形巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲、中華泰勒蟲、牛無漿體、健康牛基因組（陰性對照）為模板進(jìn)行TaqMan實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增特異性試驗(yàn)，同時設(shè)牛巴貝斯蟲基因組陽性對照和空白對照。

1.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取濃度為1.0×108～1.0×102copies/μL的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板分別進(jìn)行組內(nèi)和組間的實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增，每個稀釋度重復(fù)3次。根據(jù)循環(huán)閾值（Ct）的差異計(jì)算組內(nèi)、組間變異系數(shù)（CV）。

1.11 應(yīng)用性檢測

隨機(jī)抽取本實(shí)驗(yàn)室采集保存的37份田間DNA樣品，用建立的TaqMan實(shí)時熒光定量PCR進(jìn)行檢測，以評價該方法的實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒制備及濃度檢測

經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到284 bp的目的基因片段Bo-Rap-1a（圖1）。與pGEM-T Easy載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans DH5α感受態(tài)細(xì)胞。PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒經(jīng)測序正確后，使用NanoDrop 2000/200C超微量分光光度計(jì)測定陽性質(zhì)粒濃度，配制終濃度為1.0×109copies/μL的質(zhì)粒備用。

圖1 目的基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

經(jīng)過對TaqMan熒光定量PCR的上下游引物濃度、探針濃度、退火反應(yīng)溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化，循環(huán)閾值（Ct）最低的25 μL反應(yīng)體系為Premix ExTaqTM（2×）12.5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.5 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，探針（10 μmol/L）1 μL，水補(bǔ)齊至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。在每一循環(huán)的延伸溫度結(jié)束時設(shè)定熒光信號采集點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時檢測。用該體系對1.0×108～1.0×101copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒模板進(jìn)行實(shí)時定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)自動生成擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），方程為y=-3.362×Log（X）+43.32，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，擴(kuò)增效率為98.4%，表明線性良好，符合定量要求。

圖2 Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 牛巴貝斯蟲TaqMan熒光定量PCR的靈敏度、特異性與穩(wěn)定性檢測

靈敏度檢測中，對1.0×108～1.0×101copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒模板平行擴(kuò)增后，當(dāng)模板濃度低至1.0×101copies/μL時，熒光信號達(dá)到了檢測閾值（圖3），為了獲取更為清晰的擴(kuò)增曲線，本方法的靈敏度設(shè)定為1.0×102copies/μL。普通PCR的靈敏度為1.0×104copies/μL（圖4）。特異性檢測中，僅牛巴貝斯蟲出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（圖5）。穩(wěn)定性檢測中，標(biāo)準(zhǔn)模板在1.0×108～1.0×103copies/μL時，組內(nèi)和組間變異系數(shù)值均小于2.5%（表1），表明該方法具有良好的穩(wěn)定性。

圖3 牛巴貝斯蟲TaqMan熒光定量PCR敏感性檢測結(jié)果

圖4 常規(guī)PCR敏感性檢測結(jié)果

圖5 牛巴貝斯蟲TaqMan熒光定量PCR特異性檢測結(jié)果

表1 熒光定量PCR重復(fù)性檢測結(jié)果

2.4 應(yīng)用性檢測

對37份田間樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)陽性檢出率為67.5%（25/37），且檢測耗時短，減少了操作過程中產(chǎn)生的交叉污染。

3 討論

進(jìn)入21世紀(jì)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，應(yīng)用于巴貝斯蟲分類、鑒別和診斷的分子生物學(xué)研究方法也越來越多。由于熒光定量PCR可直接檢測病原體，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后可直接判定結(jié)果，無需進(jìn)行電泳檢測，因而加快了檢測效率，而且檢測結(jié)果通過熒光信號來判定，靈敏度高于普通PCR。該方法是疾病早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查的有效工具。因此，越來越多的巴貝斯蟲靶基因如18S rRNA、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)、線粒體DNA、細(xì)胞色素b 基因等被標(biāo)記用于牛巴貝斯蟲的熒光定量PCR方法的建立。

劉啟生等[15]針對牛巴貝斯蟲18S rRNA基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立了實(shí)時熒光PCR檢測方法，最低可檢測到1.31×101copies/μL靶基因，敏感性較常規(guī)普通PCR方法提高了1 000倍；若考慮試驗(yàn)為40個循環(huán)，其敏感性為1.31×102copies/μL靶基因。本研究建立的牛巴貝斯蟲TaqMan實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，在40個循環(huán)的基礎(chǔ)上敏感性最低可至1×102copies/μL靶基因，敏感性更強(qiáng)；該方法可更好地鑒別多種牛梨形蟲病，對牛雙芽巴貝斯蟲、大巴貝斯蟲、卵形巴貝斯蟲等7種常見的牛梨形蟲病檢測結(jié)果均為陰性；重復(fù)性好，組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于2.5%。通過對37份田間樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)陽性樣品檢出率為67.5%，表明本方法對田間樣品的感染具有較高的檢出率。

綜上所述，本試驗(yàn)建立的牛巴貝斯蟲TaqMan熒光定量PCR靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，適用于牛巴貝斯蟲的診斷，從而為該病流行病學(xué)調(diào)查提供了快速有效的檢測方法。