血清型特異性水泡性口炎病毒同步檢測(cè)和鑒別方法的建立

（中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心，北京 100026）

水泡性口炎（vesicular stomatitis，VS）是由水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）引起的多種哺乳動(dòng)物和人感染的一種人獸共患傳染病，其中馬、牛、豬和某些野生動(dòng)物較易感，綿羊和山羊也可感染，但不發(fā)生自然感染，臨床上以口、鼻等黏膜和皮膚水泡及糜爛為特征。該病可以跨界、跨物種傳播，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報(bào)動(dòng)物疫病，在我國為外來動(dòng)物疫病，是我國動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品國際貿(mào)易中的重要檢疫對(duì)象[1-5]。VSV有2個(gè)血清型，代表株分別為新澤西株（VSV-NJ）和印第安納株（VSV-IND）。易感動(dòng)物對(duì)不同血清型感受性不同，馬、牛、豬是VSV-NJ型病毒的主要自然宿主，而VSV-IND曾引起牛和馬的水泡性口炎流行，但不引起豬的疾病。這兩個(gè)血清型在血清學(xué)和免疫學(xué)上獨(dú)立，但臨床癥狀難以區(qū)分[4-8]。本研究建立了可以同步檢測(cè)和鑒別VSV-NJ和VSVIND的雙重?zé)晒釸T-PCR方法，以期為VS的防控提供技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)質(zhì)控品

VSV-NJ和VSV-IND陽性質(zhì)控品，均為本實(shí)驗(yàn)室制備的L基因體外轉(zhuǎn)錄cRNA（VSV-NJ-LcRNA和VSV-IND-L-cRNA）；測(cè)試所用的其他病毒，均為本實(shí)驗(yàn)室制備的核酸質(zhì)控品，上述核酸質(zhì)控品均按常規(guī)方法制備[9-10]。

1.2 主要試劑及儀器

pGEM-T載 體、Riboprobe RNA Production System-T7體外轉(zhuǎn)錄試劑，為Promega公司產(chǎn)品；Ex-TaqPCR試劑，為TaKaRa公司產(chǎn)品；Path-IDTMMultiplex one-step RT-PCR kit，為AB公司產(chǎn)品；TIANamp Virus DNA/RNA Kit，為天根公司產(chǎn)品；CFX-96熒光PCR儀，為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 引物和探針設(shè)計(jì)與合成

下載GenBank中現(xiàn)有VSV-NJ和VSV-IND所有分離株基因，使用CLCMain Workbench 7.0.3和BioEditor 1.6.1分析軟件進(jìn)行多重比較，選取L基因作為擴(kuò)增靶基因，根據(jù)雙重?zé)晒釸T-PCR特點(diǎn)分別設(shè)計(jì)并篩選出能覆蓋大部分分離株、又適合雙重檢測(cè)，并可以區(qū)分不同血清型的引物和探針（序列見表1）。引物和探針由TaKaRa（大連寶生物）合成，用滅菌水稀釋成100 mmol/L儲(chǔ)藏液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 陽性質(zhì)控品濃度測(cè)定

VSV-NJ-L-cRNA和VSV-IND-L-cRNA陽性質(zhì)控品經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后測(cè)定其OD260和OD280值，按照公式[6.02×1023×濃度（ng/μL）×10-9]/[片段長(zhǎng)度（bp）×660]計(jì)算拷貝數(shù)，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)

將引物和探針儲(chǔ)備液按照引物終濃度400 nmol/L和探針終濃度200 nmol/L分別進(jìn)行10倍稀釋和混合，引物混合液包括VSV-NJ引物3條和VSV-IND引物2條，探針混合液包括VSVNJ、VSV-IND探針各1條（表1）。按照表2配制反應(yīng)體系。

將混合液充分混合，最后加入模板，簡(jiǎn)短離心，按照下列程序進(jìn)行一步法雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)：48 ℃ 10 min、95 ℃ 10 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，95 ℃ 15 s變性、60 ℃ 45 s退火，44個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。

表1 新澤西型和印第安納型水泡性口炎病毒一步法雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)引物和探針

表2 一步法雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)體系

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和最低檢測(cè)限確定

分別將已知濃度的VSV-NJ和VSV-IND陽性質(zhì)控品按照10-1～10-11進(jìn)行10倍梯度稀釋后進(jìn)行熒光RT-PCR反應(yīng)，用模板濃度-熒光Ct值做單熒光RT-PCR濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，最高稀釋倍數(shù)能檢測(cè)出的Ct值所對(duì)應(yīng)的濃度即為單熒光RT-PCR最低檢測(cè)限。

再將已知濃度的VSV-NJ和VSV-IND陽性質(zhì)控品等量混合，按照10-1～10-11進(jìn)行10倍梯度稀釋后進(jìn)行雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)，用模板濃度-熒光Ct值做雙重?zé)晒釸T-PCR濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，最高稀釋倍數(shù)能檢測(cè)出的Ct值所對(duì)應(yīng)的濃度即為雙重?zé)晒釸T-PCR最低檢測(cè)限。

1.7 特異性測(cè)試

選擇實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆玫呢i流感病毒（SIV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬水泡病病毒（SVDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬瘟病毒（CSFV）、牛病毒性腹瀉黏膜病毒（BVDV）、牛地方流行性白血病病毒（EBLV）、口蹄疫病毒（FMDV）、藍(lán)舌病病毒（BTV）等9種病毒質(zhì)控品，分別用VSV-NJ和VSV-IND的引物和探針進(jìn)行單熒光RT-PCR，驗(yàn)證引物和探針的特異性。

用建立的雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)體系同時(shí)對(duì)上述9種病毒質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證引物和探針混合后雙重反應(yīng)體系的特異性。

1.8 雙重?zé)晒釸T-PCR和單熒光RT-PCR比較

將VSV-NJ和VSV-IND陽性質(zhì)控品等量混合后進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別進(jìn)行雙重?zé)晒釸TPCR和單熒光RT-PCR，將相同濃度模板對(duì)應(yīng)的熒光Ct值進(jìn)行比較，求解回歸方程，比較雙重?zé)晒釸T-PCR和各單熒光RT-PCR的符合性。

1.9 方法驗(yàn)證

用建立的雙重?zé)晒釸T-PCR對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)病毒核酸進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)50份臨床樣品進(jìn)行測(cè)試，并與單熒光RT-PCR進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 陽性質(zhì)控品定量

將保存?zhèn)溆玫年栃再|(zhì)控品，分別用紫外分光儀測(cè)定其260 nm和280 nm的吸光度值并計(jì)算出濃度和拷貝數(shù)（表3）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測(cè)限

分別用VSV-NJ和VSV-IND陽性質(zhì)控品做濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線PCR擴(kuò)增效率E值、R2和曲線斜率均在正常范圍內(nèi)，說明擴(kuò)增效率良好。將模板進(jìn)行10-11稀釋仍能檢測(cè)到熒光信號(hào)，根據(jù)表3濃度，計(jì)算出對(duì)應(yīng)的最低檢測(cè)限在10 copies/μL左右。

VSV-NJ和VSV-IND混合質(zhì)控品雙重?zé)晒釸T-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。從圖2可知，雙重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增效率E值分別為99.5%和99.0%，R2值分別為0.999和0.998，曲線斜率均在正常范圍內(nèi)，說明擴(kuò)增效率并沒有受到雙重干擾。相同稀釋倍數(shù)對(duì)應(yīng)的Ct值比單熒光RT-PCR略有升高，但不構(gòu)成顯著差異，最低檢測(cè)限仍然可達(dá)10 copies/μL。

2.3 特異性檢測(cè)

單個(gè)病毒的引物和探針只能擴(kuò)增出各自的病毒核酸，其他病毒模板的擴(kuò)增均為陰性，表明所設(shè)計(jì)的引物和探針特異性良好。利用建立的雙重?zé)晒釸T-PCR方法對(duì)VSV-NJ和VSV-IND及1.7中所列病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果僅VSV-NJ和VSVIND有擴(kuò)增曲線，其他病毒均無特異性擴(kuò)增信號(hào)（表4），表明所建立的方法特異性良好，雙重并沒有對(duì)特異性產(chǎn)生干擾。

表3 陽性質(zhì)控品純度及含量測(cè)定

圖1 VSV-NJ（A）與VSV-IND（B）的熒光RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 VSV-NJ和VSV-IND雙重?zé)晒釸T-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 雙重?zé)晒釸T-PCR和單熒光RT-PCR比較

利用相同濃度的混合模板同時(shí)進(jìn)行雙重?zé)晒釸T-PCR和單熒光RT-PCR的符合性測(cè)試，回歸方程計(jì)算結(jié)果顯示，VSV-NJ和VSV-IND單熒光RTPCR與雙重?zé)晒釸T-PCR的相關(guān)性系數(shù)R2分別為0.9997和0.9994，說明雙重?zé)晒釸T-PCR和各單熒光RT-PCR的符合性良好，對(duì)于相同濃度的模板，其Ct值基本一致，所有引物和探針放在一個(gè)反應(yīng)體系混合后并沒有相互干擾（圖3）。

圖3 VSV-NJ（A）和VSV-IND（B）單熒光RT-PCR與雙重?zé)晒釸T-PCR的比較

表4 特異性檢測(cè)結(jié)果

2.5 驗(yàn)證

利用本研究建立的雙重?zé)晒釸T-PCR對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的2份VSV-NJ和2份VSV-IND細(xì)胞培養(yǎng)病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陽性；對(duì)50份臨床樣品的篩查結(jié)果均為陰性，與單熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致。

3 討論

VS是人獸共患傳染病，多種動(dòng)物易感，常見于馬、騾、牛、豬和野生動(dòng)物，羊一般不發(fā)生自然感染，不同動(dòng)物感染臨床癥狀相似。VSV的2個(gè)血清型VSV-NJ和VSV-IND對(duì)易感動(dòng)物的感受性不同，其中馬、牛、豬是VSV-NJ的主要自然宿主，而馬和牛經(jīng)常感染VSV-IND，但豬一般不感染VSV-IND[1-2]。VSV的診斷主要靠血清學(xué)和分子生物學(xué)方法，ELISA方法是使用最廣泛的血清學(xué)試驗(yàn)，但不能區(qū)分VSV的兩個(gè)血清型，而這兩個(gè)血清學(xué)感染后癥狀相同，臨床上難以區(qū)分[1-2]。因此，本研究借助不同血清型的特異性基因序列，設(shè)計(jì)了針對(duì)兩個(gè)血清型的特異性引物和探針，建立了可以同步檢測(cè)和鑒別VSV-NJ和VSV-IND的雙重?zé)晒釸T-PCR方法。

該方法與Hole、Femandez等[4-6]人的研究方法相比，最低檢測(cè)限可達(dá)10 copies/μL，達(dá)到了目前熒光PCR技術(shù)的較好敏感性指標(biāo)[7，11-12]；特異性為100%，不管是單模板，還是混合模板，引物和探針均只能擴(kuò)增出各自的目標(biāo)病原，其他相關(guān)病毒測(cè)試均未見非特異性擴(kuò)增；結(jié)果表明，建立的雙重?zé)晒釸T-PCR與單熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，可快速、同步檢測(cè)VSV-NJ和VSV-IND，從而為VS的防控工作提供了技術(shù)儲(chǔ)備。