益母草堿對胚胎-胎仔發(fā)育毒性和遺傳毒性的評價(jià)

田逸君，朱玉平，馬璽里，嚴(yán) 朗，勝呂綸貴子，鄭怡文 （. 海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍醫(yī)學(xué)系衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，上海 00433；. 復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 00433）

益母草（Leonurus japonicusHoutt.）作為傳統(tǒng)中藥，以往主要用于治療婦產(chǎn)科疾病。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，益母草中的主要化學(xué)成分為生物堿、類黃酮和二萜等[1]，其中，益母草堿（4-胍基-正丁基-丁香酸酯，又名SCM-198）是一種具有抗血小板聚集[2]、改善微循環(huán)、保護(hù)心肌[3-4]等多種生物活性的重要生物堿，有廣泛的臨床應(yīng)用前景[5-7]。本研究采用SD 大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)方法對益母草堿的致畸性進(jìn)行評價(jià)；同時(shí)采用Ames 試驗(yàn)、體外CHO 細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)和小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)這3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合的方法，分別從體外到體內(nèi)，從微生物、離體真核細(xì)胞到整體動(dòng)物水平系統(tǒng)檢測其致突變性[8-9]，旨在為臨床安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 受試物

益母草堿（含量99.09%，復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，批號：20 110 329）。使用前以0.5% CMC-Na 溶液配制成混懸液，供試；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，批號：F20100420，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；DMSO（批號：T20101110，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；絲裂霉素C（批號：101 202，浙江海正藥業(yè)股份有限公司）；環(huán)磷酰胺（ 批號：10 110 621，江蘇恒瑞藥業(yè)股份有限公司）；敵克松（批號：PS-262）、甲基磺酸甲酯（批號：129 925）、4-硝基喹啉-N-氧化物（批號：N8141）、2-氨基芴（批號：A5550-0）、1,8-二羥基蒽醌（批號：S52075-139）均購自Sigma 公司；大鼠肝微粒體酶S9（批號：2 715，美國Moltox 公司）；組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌共5 支，分別為TA97、TA98、TA100、TA102 和TA1535 菌株，由國家上海新藥安全性評價(jià)中心贈(zèng)予，儲(chǔ)存于液氮中。中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞由復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理教研室贈(zèng)予,儲(chǔ)存于液氮中。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

SD 大鼠（SPF 級），雌性100 只，雄性80 只。雌鼠5～6 周齡，體重110～140 g；雄鼠6～7 周齡，體重150～180 g（上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號：2008001629237。ICR 小鼠（SPF 級），共46 只，雌 雄各半。雌鼠7～8 周齡，體重21～23 g；雄鼠7～8 周齡，體重23～25 g（上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號：2008001610906。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2008-0016，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK（滬）2007-0003。

2 方法

2.1 胚胎-胎鼠發(fā)育毒性試驗(yàn)

按《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[10-11]的要求，將雌鼠與雄鼠1:1 合籠，交配第2 天起對雌鼠進(jìn)行陰道涂片檢查，若顯微鏡下查見精子則視為交配成功，成功當(dāng)天即為妊娠GD0。然后將這部分雌鼠按體重隨機(jī)分為4 組，每組20 只。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果提示SD 大鼠經(jīng)口灌胃給予益母草堿，最大耐受量（MTD）＞5 000 mg/kg，因此，本試驗(yàn)設(shè)高、中、低劑量組（2 000、1 000 和500 mg/kg 體重），另設(shè)溶媒對照組，分別對不同組別的雌鼠連續(xù)灌胃給藥10 d（給藥起止時(shí)間為GD6～GD15）。于GD0、GD5、GD6～GD15和GD20時(shí)稱取孕鼠的體重。在GD20時(shí)處死孕鼠，觀察外觀是否異常，同時(shí)記錄其活胎數(shù)（區(qū)分雌雄）、黃體數(shù)、著床數(shù)、死胎數(shù)等。所有的胎鼠，取其中約一半數(shù)量固定于Bouin 液中作內(nèi)臟檢查，另一半固定于75%乙醇中制作骨骼標(biāo)本，用于骨骼畸形檢查。

2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

按《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[12-13]的要求，分別應(yīng)用反映基因突變的Ames 試驗(yàn)[14]、反映染色體畸變的染色體畸變試驗(yàn)（體外培養(yǎng)CHO細(xì)胞）[15]和小鼠微核試驗(yàn)（體內(nèi)）[16]方法。

2.2.1 Ames 試驗(yàn)

應(yīng)用TA97、TA98、TA100、TA102 和TA1535 這5 支菌株，設(shè)5 個(gè)劑量組（5 000、500、50、5、0.5 μg/皿），此外還設(shè)空白對照、溶媒對照和陽性對照組，每個(gè)劑量組及對照組均設(shè)3 個(gè)平行皿（具體劑量見表1）。采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法，使細(xì)菌在有或無代謝活化系統(tǒng)S9 的條件下接觸受試物，并用最低極限的瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48～72 h 后，先用顯微鏡觀察平皿上的菌苔生長情況，確定受試物無明顯的抑菌或殺菌作用，再人工計(jì)數(shù)每皿回復(fù)突變的菌落數(shù)，記錄原始數(shù)據(jù)，并計(jì)算每組的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，與溶媒對照組進(jìn)行比較[8,17-18]。重復(fù)試驗(yàn)一次。

2.2.2 染色體畸變試驗(yàn)

在有或無代謝活化系統(tǒng)S9 的條件下，在體外培養(yǎng)的CHO 細(xì)胞中加入對應(yīng)的不同濃度的受試物或?qū)φ掌?，反?yīng)體系總體積為10 ml。高、中、低劑量組受試物終濃度依次為1 000、500 和250 μg/ml，陽性對照組絲裂霉素C 和環(huán)磷酰胺的終濃度分別為0.5、60 μg/ml，另設(shè)溶媒對照組分別作用于細(xì)胞4 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，最后收集細(xì)胞。用秋水仙堿處理所有細(xì)胞，將細(xì)胞終止在有絲分裂中期，經(jīng)0.75%氯化鉀低滲、1∶3 醋酸甲醇固定、滴片和Giemsa 染色后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)和觀察染色體的數(shù)量或結(jié)構(gòu)是否改變[8,17-18]。

表1 陽性對照品的名稱及劑量

觀察對象的選擇為染色體分散良好、數(shù)目完整的中期分裂相細(xì)胞，采用盲法讀片，受試物及溶媒對照組每組觀察200 個(gè)細(xì)胞，陽性對照組觀察100 個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)染色體或染色單體的斷裂、缺失及其他類型結(jié)構(gòu)異常的數(shù)目[8,17-18]（裂隙和核內(nèi)復(fù)制一般不作為畸變類型），計(jì)算畸變率。

2.2.3 骨髓微核試驗(yàn)

受試物采用經(jīng)口灌胃的方式（與臨床給藥途徑一致）給藥，急性毒性試驗(yàn)結(jié)果提示ICR 小鼠經(jīng)口灌胃給予益母草堿，MTD＞5 000 mg/kg，故高、中、低劑量分別設(shè)為2 000、1 000 和500 mg/kg 體重，同時(shí)設(shè)溶媒對照及陽性對照組。給藥容積為10 ml/kg體重。以40 mg/kg 體重的劑量腹腔注射給予環(huán)磷酰胺（陽性對照），給藥容量為10 ml/kg 體重。溶媒對照組以10 ml/kg 體重的容積經(jīng)口灌胃給予0.5%CMC-Na 溶液。小鼠在給藥24 h 后處死，每只動(dòng)物取其兩側(cè)股骨骨髓，制2 張涂片，用甲醇固定，然后用pH6.8 的Giemsa 染液進(jìn)行染色。

每只小鼠鏡檢1 000 個(gè)骨髓嗜多染紅細(xì)胞（PCE），計(jì)數(shù)含微核的PCE 數(shù)（MNPCE），計(jì)算微核發(fā)生率，同時(shí)記錄200 個(gè)PCE 計(jì)數(shù)過程中觀察到的正染紅細(xì)胞（NCE）的數(shù)目，并計(jì)算PCE/NCE 值，以評價(jià)受試物是否有骨髓毒性[8,17-18]。

3 統(tǒng)計(jì)分析[8, 17-18]

3.1 胚胎-胎鼠發(fā)育毒性試驗(yàn)

3.2 Ames 試驗(yàn)

比較受試物各劑量組與溶劑對照組的回復(fù)突變菌落數(shù)，若某劑量組回復(fù)突變菌落數(shù)為溶劑對照組的2 倍以上，呈現(xiàn)可重復(fù)性，并在一定的劑量范圍內(nèi)存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，則判斷為陽性。

3.3 染色體畸變試驗(yàn)

染色體畸變細(xì)胞的發(fā)生率須與溶媒對照組進(jìn)行比較分析后方可判定，＞10%者判為陽性。

3.4 骨髓微核試驗(yàn)

采用χ2檢驗(yàn)比較給藥組與對照組之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 胚胎-胎鼠發(fā)育毒性結(jié)果

益母草堿各受試劑量作用下在給藥期間（GD6～GD15）、停藥后（GD15～GD20）以及整個(gè)孕期（GD0～GD20）孕鼠的增重與對照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各受試劑量組子宮連胎重量、子宮重量、黃體數(shù)、著床率、每窩平均活胎數(shù)、死胎數(shù)和吸收胎數(shù)、活胎率、死胎發(fā)生率、吸收胎發(fā)生率與對照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外，各組胎鼠均未觀察到內(nèi)臟和外觀畸形的發(fā)生。以上研究結(jié)果提示，益母草堿在各受試劑量下未觀察到明顯的母體毒性、胚胎毒性和致畸作用。

由表2 可見，受試物各劑量組胎鼠的體重、身長、胎盤重量及性別比例與溶媒對照組相比無明顯差異，提示益母草堿在各受試劑量下未觀察到明顯的胎兒毒性。

由表3～5 可見，受試物各劑量組胎鼠觀察指標(biāo)的數(shù)目及發(fā)育程度與溶媒對照組相比無明顯差異，提示益母草堿在各受試劑量下對胎鼠骨骼的發(fā)育未見明顯影響。

表2 益母草堿對胎鼠生長發(fā)育的影響

4.2 Ames 試驗(yàn)結(jié)果

受試物各劑量組和對照組的平皿通過肉眼觀察均未見污染，并且在顯微鏡下可見背景菌苔生長。試驗(yàn)結(jié)果見表6、表7，5 個(gè)菌株的自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)以及陽性對照品誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)均在歷史對照范圍內(nèi)，并且各菌株陽性對照組的回復(fù)突變菌落數(shù)與空白對照組相比顯著增加，提示本試驗(yàn)系統(tǒng)符合試驗(yàn)要求。在最高劑量已達(dá)到5 000 μg/皿的受試條件下，未觀察到受試物的抑菌現(xiàn)象[8,17-19]。各劑量組受試物在有或無代謝活化系統(tǒng)S9 的條件下，對5 支菌株所誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)均與溶媒對照組的突變菌落數(shù)相近，并且未觀察到明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系（表8）。

表3 益母草堿對胎鼠骨骼發(fā)育的影響

4.3 染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果

陽性對照組能夠誘發(fā)受試細(xì)胞染色體的畸變率明顯增高，24 h 在有或無代謝活化系統(tǒng)S9 的情況下，染色體畸變率分別為17%和18%，均＞10%，為陽性結(jié)果；溶媒對照品以及250、500 和1 000 μg/ml受試物在24 h、有S9 組的染色體畸變率分別為1.5%、1.0%、0.5%和1.5%；24 h、無S9 組的染色體畸變率分別為1.0%、1.0%、1.5%和0.5%，綜上，溶媒對照組及受試物各劑量組細(xì)胞染色體畸變率均小于5%，為陰性結(jié)果[8,17-18]。

4.4 小鼠骨髓微核試驗(yàn)的結(jié)果

各劑量組小鼠在給藥后均未見異常。微核試驗(yàn)閱片結(jié)果見表9。益母草堿在各受試劑量下未觀察到對小鼠骨髓的抑制作用，溶媒對照組雌性和雄性小鼠骨髓的PCE 微核發(fā)生率分別為4.09‰和2.94‰，陽性對照組雌性和雄性小鼠骨髓PCE 微核發(fā)生率分別為15.93‰和16.28‰，與溶媒對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，受試物在500、1 000、2 000 mg/kg 劑量下對雌性ICR 小鼠骨髓PCE 微核誘發(fā)率分別為2.53‰、2.16‰和2.17‰，對雄性ICR小鼠骨髓PCE 微核誘發(fā)率分別為0.78‰、0.79‰和2.96‰，由上述結(jié)果可見，受試物各劑量組均未誘發(fā)ICR 小鼠骨髓PCE 微核率的明顯增高[8,17-18,20]。

表4 益母草堿對胎鼠枕骨發(fā)育的影響

表5 益母草堿對胎鼠胸骨節(jié)骨骼發(fā)育的影響

表6 益母草堿對5 支菌株的回變菌落數(shù)試驗(yàn)結(jié)果(個(gè)/皿, ± s)（第1 次）

表6 益母草堿對5 支菌株的回變菌落數(shù)試驗(yàn)結(jié)果(個(gè)/皿, ± s)（第1 次）

組別(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535+S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 5 000 84±5 70±3 50±3 53±7 86±8 74±3 203±42 193±62 11±4 12±5 500 85±10 79±8 32±9 44±5 91±18 77±13 213±80 174±11 9±3 8±2 50 76±8 71±6 37±5 40±10 72±3 82±15 196±24 184±13 9±1 9±3 5 92±12 81±1 33±4 34±7 87±18 69±13 218±50 176±8 9±2 9±2 0.5 86±25 71±8 37±6 38±9 82±8 80±9 176±48 159±16 10±4 8±2空白對照組 77±5 75±6 35±12 42±11 90±14 77±13 207±50 194±25 12±7 10±3溶媒對照組 75±13 77±6 40±14 52±4 90±9 88±11 178±62 172±40 13±3 13±1陽性對照組 745±49 1 067±176 467±115 711±87 578±61 486±34 636±41 634±32 467±82 433±15

表7 益母草堿對5 支菌株的回變菌落數(shù)(個(gè)/皿， ±s )（第2 次）

表7 益母草堿對5 支菌株的回變菌落數(shù)(個(gè)/皿， ±s )（第2 次）

組別(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535+S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 5 000 83±7 80±9 32±4 33±8 94±16 93±7 211±13 196±18 9±2 9±6 500 79±11 79±10 26±4 30±6 78±5 79±7 208±6 195±7 9±1 10±3 50 74±13 74±11 32±4 31±3 95±27 86±8 187±9 195±42 8±2 11±2 5 86±6 79±16 31±4 35±5 83±10 85±14 179±4 177±62 9±1 7±2 0.5 84±9 85±7 26±6 27±2 110±20 91±11 190±1 186±18 8±2 12±5空白對照組 76±5 80±14 32±6 30±11 88±2 102±10 212±6 176±46 10±2 8±1溶媒對照組 83±3 79±12 29±3 37±11 84±2 89±9 192±15 184±33 8±2 10±2陽性對照組 807±5 806±90 934±64 851±163 446±40 496±21 623±23 621±37 480±35 476±53

表8 益母草堿對24 h 體外培養(yǎng)CHO 細(xì)胞的染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果（加或不加S9 系統(tǒng)）

表9 益母草堿對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞的微核效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

5 討論

益母草作為傳統(tǒng)中藥，其應(yīng)用廣泛且歷史悠久，主要用于治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、惡露等婦科疾病，同時(shí)還用于消腫化瘀、排水利尿。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已證明益母草中的生物堿——益母草堿在其中發(fā)揮了主要功效，益母草堿具有溶栓、抗凝、降低血脂和血液黏度、抑制紅細(xì)胞和血小板聚集[2]等多種功能，對改善微循環(huán)、抗自由基活性和減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載[3-4]也有顯著作用。上述功能有助于預(yù)防心血管疾病和腦血管疾病，抑制心肌纖維化[7]、改善認(rèn)知、促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)[21]、抗炎[22]、防治糖尿病[23]等，因此，益母草堿在心腦血管、代謝病、腎病、生殖[24]等臨床研究領(lǐng)域有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用前景[5-7]。進(jìn)行安全性評價(jià)是藥物研發(fā)和安全使用的重要環(huán)節(jié)，但目前對益母草堿的基礎(chǔ)毒性和特殊毒性的研究尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。研究其遺傳毒性和生殖毒性對于臨床安全用藥具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究采用國際通用的研究方法，對益母草堿的生殖毒性和遺傳毒性進(jìn)行了系統(tǒng)的評價(jià)。在胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究中，自大鼠胚胎著床至硬腭閉合這個(gè)階段孕鼠口服益母草堿，通過觀察受試物對妊娠動(dòng)物、胚胎及胎仔發(fā)育的影響檢測其致畸性。藥物遺傳毒性的研究根據(jù)國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，必須遵循原核生物與真核生物、體內(nèi)系統(tǒng)與體外系統(tǒng)相結(jié)合的原則進(jìn)行，本研究采用Ames 試驗(yàn)、體外CHO 細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)和小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)三者標(biāo)準(zhǔn)組合方案，其檢測范圍涵蓋了基因突變、染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目畸變等多個(gè)遺傳學(xué)終點(diǎn)。Ames 試驗(yàn)用于檢測DNA 損傷引起的基因突變，組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his-）鼠傷寒沙門菌在受到誘變劑作用后會(huì)發(fā)生大量回復(fù)突變，可自行合成組氨酸，形成肉眼可見的菌落。某些化學(xué)物質(zhì)需經(jīng)代謝活化后才具有致突變作用，因此，在測試系統(tǒng)中又設(shè)置了平行組加入哺乳動(dòng)物微粒體酶，以彌補(bǔ)體外試驗(yàn)缺乏代謝活化系統(tǒng)的不足。染色體畸變試驗(yàn)常用于檢測化合物是否引起細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的改變。誘變因素在損傷染色體的同時(shí)也可能損傷紡錘體，從而導(dǎo)致染色體的丟失并形成微核，應(yīng)用微核試驗(yàn)檢測染色體或有絲分裂器的損傷，具有直觀、簡便等優(yōu)勢[9]。

研究結(jié)果顯示，在本試驗(yàn)劑量條件下，益母草堿未觀察到明顯的胚胎-胎仔發(fā)育毒性以及遺傳毒性，該結(jié)論可為益母草堿在臨床上的安全使用提供參考和指導(dǎo)，有助于降低用藥風(fēng)險(xiǎn)。