重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激對(duì)雌性大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的影響*

韓 潔，劉子怡，方 振，田 蕾，楊丹鳳，襲著革△，劉曉華△

(1. 天津體育學(xué)院，天津 301617； 2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050； 3. 濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264000)

隨著社會(huì)的快速發(fā)展和自然災(zāi)害的頻繁發(fā)生，人們面臨的壓力(應(yīng)激)越來越大，有研究證明，女性更容易受應(yīng)激的影響發(fā)展成相關(guān)心理疾病，發(fā)生率是男性的2倍[1]。大量臨床資料表明，軀體和心理應(yīng)激均能在下丘腦-垂體-卵巢(hypothalamic-pituitary-ovarian，HPO)軸多水平抑制或損害女性生殖內(nèi)分泌功能，從而導(dǎo)致女性亞健康狀態(tài)、臨床婦科疾病和女性早衰。月經(jīng)失調(diào)、無排卵月經(jīng)、閉經(jīng)、不孕[2-5]等與多種社會(huì)和精神因素引起的身心應(yīng)激密切相關(guān)。

大鼠長(zhǎng)期暴露在生理應(yīng)激條件下(強(qiáng)迫游泳、限制進(jìn)食、溫度應(yīng)激)可導(dǎo)致動(dòng)情周期改變[6]，慢性輕度應(yīng)激(chronic mild stress，CMS)會(huì)引起雌性大鼠情期紊亂，主要表現(xiàn)為發(fā)情周期延長(zhǎng)[7]。Goya[8]等研究表明，束縛應(yīng)激(1 h)降低小鼠促性腺激素水平，尤其是 LH 的明顯減少。Konstantinov[9]等在束縛應(yīng)激的大鼠中觀察到黃體數(shù)大大減少，卵巢萎縮，輸卵管炎性阻塞，子宮內(nèi)膜增厚折疊，內(nèi)膜上皮下出現(xiàn)大量的組織細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。慢性束縛應(yīng)激動(dòng)物模型是一種能引起典型非特異性應(yīng)激反映的有效方法，與人類身心性疾病過程相似，是經(jīng)典的心理應(yīng)激模型[10]，雖然許多學(xué)者曾經(jīng)研究過其對(duì)女性生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)所帶來的危害，但對(duì)其具體機(jī)制并不是很了解，本研究建立重復(fù)制動(dòng)對(duì)SD雌性大鼠動(dòng)情周期影響的動(dòng)物模型，了解重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激對(duì)HPO的影響及其相關(guān)機(jī)制，對(duì)于防治人類生殖系統(tǒng)疾病，保障女性生殖健康具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

束縛器(L210×I.D.55mm，深圳沃德生命科技有限公司，中國(guó))，10%甲醛固定液、無水乙醇、二甲苯和蘇木素-伊紅(HE)染液(Solarbio公司)，雌二醇(estradiol, E2)、孕酮(progesterone, P)、卵泡生成素(follicle-stimulating hormone, FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone, LH)、睪酮(testosterone, T)和催乳素 (prolactin, PRL)試劑盒(Biorbyt,英國(guó))，Trizol試劑(Invitrogen，美國(guó))，Revertaid逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo，美國(guó))，SYBR Mix(Takara，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

成年SD雌性大鼠7～8周，體重(200±10)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。在溫度(23±1)℃、濕度(50±5)%和12∶12 h明暗循環(huán)的環(huán)境控制室內(nèi)飼養(yǎng)。所有老鼠均可自由活動(dòng)，正常飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，選擇具有兩個(gè)連續(xù)規(guī)律動(dòng)情周期的動(dòng)物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

40只雌性SD大鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組20只，實(shí)驗(yàn)組每天置于束縛器內(nèi)制動(dòng)應(yīng)激一次(從上午9:00開始)，第1日制動(dòng)2 h，以后采用遞增負(fù)荷，每日增加0.5 h，持續(xù)兩周，對(duì)照組在環(huán)境控制室內(nèi)正常飼養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)期間，所有動(dòng)物都禁食禁水，每周稱取一次體重，每日于8:00和20:00進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片并用HE染色，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化判斷大鼠的動(dòng)情周期，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照國(guó)家動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

1.3 組織樣本收集

兩周后于動(dòng)情間期處理大鼠，用1%戊巴比妥鈉麻醉后腹主動(dòng)脈取血，室溫放置20 min后，將血液以3 000 r/min，4℃，離心10 min，收集上清液，于-80℃冷凍保存。采血后取大鼠下丘腦、垂體、卵巢和子宮，組織離體后于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈，濾紙吸干，稱量卵巢和子宮濕重計(jì)算其臟器系數(shù)。

臟器系數(shù)(%)=臟器濕重(g)/體重(g)×100 %

1.4 病理檢查

稱重后將卵巢和子宮于4%的多聚甲醛溶液中固定，72 h常規(guī)沖洗，脫水透明，石蠟包埋，4～6 μm組織切片，60～65℃烤片,30 min 脫蠟，HE染色，封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組織的病理變化。

1.5 血清性激素測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清性激素E2、P、FSH、LH、T 和 PRL水平，按照試劑盒操作步驟，用酶標(biāo)儀檢測(cè)待測(cè)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品450 nm處的OD值，根據(jù)OD值和濃度據(jù)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算各樣本濃度。

1.6 Quantitative real-time PCR檢測(cè)目的基因

按Trizol試劑說明書提取大鼠下丘腦、垂體、卵巢和子宮的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA是由Revertaid逆轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)制造商的說明合成的，根據(jù)cDNA設(shè)計(jì)PCR引物,由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成,引物序列見表1，PCR是采用SYBR Mix進(jìn)行檢測(cè)，PCR的反應(yīng)條件如下：95℃ 5 min；95℃ 5 s和60℃ 30 s 循環(huán)40次；95℃ 15 s；60℃ 1 min。用 2-ΔΔCT計(jì)算各個(gè)樣本目的基因的相對(duì)表達(dá)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激對(duì)雌鼠體重和臟器系數(shù)的影響

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組束縛一周和兩周后體重顯著低于對(duì)照組(P<0.01,圖1A)。實(shí)驗(yàn)組卵巢臟器系數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05),子宮臟器系數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05,圖2A)。

2.2 重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激對(duì)雌鼠動(dòng)情周期的影響

通過陰道細(xì)胞涂片和細(xì)胞學(xué)觀察判斷大鼠動(dòng)情周期,動(dòng)情前期(圖2A)以有核上皮細(xì)胞為主，動(dòng)情期(圖2B)以角質(zhì)化上皮細(xì)胞為主，動(dòng)情后期 (圖2C)以有核上皮細(xì)胞、角化上皮細(xì)胞和白細(xì)胞為主。動(dòng)情間期(圖2D)以白細(xì)胞浸潤(rùn)為主。結(jié)果表明，對(duì)照組呈現(xiàn)規(guī)律動(dòng)情周期變化，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)情間期明顯延長(zhǎng)(P<0.01,圖2E)。

Tab. 1 Gene-specific forward and reverse primer sequences

Fig. 1 Effects of repeated immobilization stress on body weight and organ n=20)

Fig. 2 Effects of repeated immobilization stress on estrous n=20)

2.3 重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激對(duì)雌鼠卵巢和子宮結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組卵巢整體結(jié)構(gòu)正常，卵母細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，透明帶光滑，周邊顆粒細(xì)胞排列有序，組織未見明顯出血壞死(圖3A)，實(shí)驗(yàn)組卵巢組織髓質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，可見廣泛水腫，部分水腫至空泡變性，可見明顯充血，組織可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3B)。

對(duì)照組子宮整體結(jié)構(gòu)正常，腔壁結(jié)構(gòu)各層完整清晰，上皮細(xì)胞呈單層柱狀，排列整齊，全層未見充血水腫，組織未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3C),實(shí)驗(yàn)組子宮間質(zhì)可見明顯水腫，部分水腫至空泡變性，組織可見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3D，圖3見彩圖頁(yè)Ⅲ)。

2.4 重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激對(duì)雌鼠性激素的影響

實(shí)驗(yàn)組血液中LH和P含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),E2含量顯著低于對(duì)照組(P<0.01),兩組間FSH、T和PRL含量均無顯著性差異(表2)。

Tab. 2 Effects of repeated immobilization stress on sex n=20)

2.5 HPO軸相關(guān)基因表達(dá)水平

我們利用qPCR技術(shù)檢測(cè)下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH); 垂體促性腺激素釋放激素受體(gonadotropin releasing hormone receptor, GnRHR)、FSH和LH，卵巢卵泡生成素受體(follicle-stimulating hormone receptor, FSHR)、黃體生成素受體 (luteinizing hormone receptor, LHR)和雌激素受體α亞型(estrogen receptor, ERα )；子宮ERα mRNA的表達(dá)(圖4)。實(shí)驗(yàn)組下丘腦GnRH表達(dá)量顯著下降(P<0.01)，垂體GnRHR和FSH表達(dá)量顯著下降(P<0.01)，LH表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，卵巢FSHR和LHR表達(dá)量顯著上升(P<0.01)，ERα表達(dá)量顯著下降(P<0.01)，子宮ERα表達(dá)量顯著下降(P<0.01)。

3 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展，心理應(yīng)激已經(jīng)成為威脅機(jī)體身心健康不可忽視的一個(gè)因素，心理應(yīng)激可對(duì)機(jī)體生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)帶來不良的影響[11]，心理應(yīng)激在HPO軸上產(chǎn)生多水平的抑制或損傷，嚴(yán)重?fù)p傷女性生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)[12, 13]，F(xiàn)enster[14]等對(duì)加利福尼亞州的276名18到39歲的健康已婚女性進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示，工作緊張度高的比工作緊張度低的女性月經(jīng)周期平均縮短超過1 d。本文通過采用束縛應(yīng)激的方法模擬多次承受心理應(yīng)激的狀態(tài)，采取遞增負(fù)荷的方式為防止出現(xiàn)適應(yīng)應(yīng)激狀態(tài)，從而能夠建立內(nèi)分泌紊亂動(dòng)物模型來探討其對(duì)HPO軸的影響。

Fig. 4 Effect of repeated immobilization stress on HPO axis-related mRNA n=20)

重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激對(duì)大鼠的能量代謝產(chǎn)生影響，會(huì)抑制大鼠體重增長(zhǎng)，這與之前的研究一致[15]，器官系數(shù)是一種靈敏、有效、客觀的反映其對(duì)靶器官影響的指標(biāo)，本文發(fā)現(xiàn)卵巢臟器系數(shù)顯著下降，子宮臟器系數(shù)顯著上升，表明卵巢和子宮可能為其靶器官。

雌鼠正常的動(dòng)情周期為4～5 d，通過陰道細(xì)胞涂片可以觀察到動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期[16]，大鼠長(zhǎng)期暴露在生理應(yīng)激條件下(強(qiáng)迫游泳、限制進(jìn)食、溫度應(yīng)激)均會(huì)導(dǎo)致動(dòng)情期改變[17]，重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激后雌鼠動(dòng)情周期明顯延長(zhǎng)，尤其是動(dòng)情間期明顯延長(zhǎng)，雌鼠的動(dòng)情周期常被用作體內(nèi)激素變化和卵巢、子宮病理生理狀態(tài)的生物標(biāo)志物[18]，不規(guī)律的動(dòng)情周期可能與雌鼠卵泡發(fā)育有關(guān)[19]。通過HE染色對(duì)卵巢和子宮的結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，可發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組卵巢和子宮均出現(xiàn)水腫和炎癥，與之前的報(bào)道一致[15, 20],重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激可能會(huì)對(duì)生殖系統(tǒng)帶來?yè)p害，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

下丘腦產(chǎn)生GnRH，作用于垂體前葉引起FSH、LH的釋放。FSH 的主要功能是刺激卵巢生長(zhǎng)及卵泡發(fā)育; LH 的功能是促進(jìn)卵泡最后成熟，觸發(fā)排卵，促進(jìn)黃體形成維持其功能;二者相互配合，促進(jìn)卵巢合成分泌3種性激素，即雌激素、孕激素、雄激素[21, 22]。此外，PRL可通過短路反饋影響下丘腦多巴胺神經(jīng)元的分泌率，從而影響GnRH的合成與釋放[23]。因此有必要測(cè)量性激素水平。臨床研究表明擁有過高感知覺壓力的女性LH水平降低，F(xiàn)SH水平增高，血清E2和P水平降低[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組LH、E2和P顯著下降，但血清FSH與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

在大鼠性成熟過程中，下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)軸調(diào)節(jié)HPO軸，HPA軸在多個(gè)水平上對(duì)HPO軸有促進(jìn)和抑制的作用。有研究曾經(jīng)表明，HPA軸主要通過促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)和糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)的合成和分泌影響HPO軸的內(nèi)分泌，阿片系統(tǒng)也參加HPO軸功能應(yīng)激性抑制作用。CRH作為HPA軸的中心驅(qū)動(dòng)力，是由下丘腦室旁核(hypothalamic paraventricular nucleus，PVN)的小細(xì)胞神經(jīng)元表達(dá)，并且分泌到垂體門脈系統(tǒng)中，從而刺激垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)分泌，后者誘導(dǎo)腎上腺皮質(zhì)的GC的生物合成和釋放。GC調(diào)節(jié)HPO軸下丘腦GnRH和垂體Gn的合成和釋放。μ-阿片受體系統(tǒng)通過β-內(nèi)啡肽的結(jié)合發(fā)揮特別重要的作用，β-內(nèi)啡肽由腦垂體和下丘腦中的前體分子產(chǎn)生，結(jié)合后，β-內(nèi)啡肽抑制下丘腦的脈沖GnRH分泌。下丘腦系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)GnRH分泌[25]。本實(shí)驗(yàn)觀察到下丘腦GnRH mRNA表達(dá)量顯著下降，Dobson[26]等人研究發(fā)現(xiàn)，急性應(yīng)激會(huì)抑制綿羊GnRH的釋放，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果一致，重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激可能通過HPA軸和HPO軸的共同作用下抑制GnRH的釋放，下丘腦GnRH通過與促性腺細(xì)胞表面的GnRHR相互作用作用于垂體，GnRHR的激活可促進(jìn)LH和FSH的合成，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育和排卵[27]，在本實(shí)驗(yàn)中GnRH釋放受到抑制，從而使GnRHR mRNA的表達(dá)水平下降, Lisowski[28]等人用GnRH 拮抗劑處理體外培養(yǎng)的豬垂體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)FSHβ和 LHβmRNA表達(dá)水平均下降，本實(shí)驗(yàn)中垂體FSH和LH mRNA的表達(dá)水平顯著下降，與之前一致。下丘腦-垂體軸釋放的 FSH 和 LH 主要通過卵巢上的 FSHR 和 LHR 介導(dǎo)調(diào)控生殖細(xì)胞的成熟和排卵。Liu[29]等在研究 TDCPP/TPP 對(duì)斑馬魚 HPG 軸基因表達(dá)的影響中發(fā)現(xiàn)，TDCPP/TPP 暴露導(dǎo)致斑馬魚卵巢中 FSHR和 LHR 表達(dá)顯著下調(diào)，在本實(shí)驗(yàn)中卵巢FSHR和LHR mRNA表達(dá)水平顯著上升，可能是重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激導(dǎo)致垂體分泌 FSH、LH 減少，對(duì)下丘腦-垂體軸產(chǎn)生正反饋調(diào)節(jié)作用，促使機(jī)體合成和釋放更多的 FSH 與 LH，與卵巢上的受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而使卵巢FSHR和LHR mRNA表達(dá)水平上升，雌激素在體內(nèi)作用依靠與ER 結(jié)合，研究表明環(huán)境雌激素能通過ER 介導(dǎo)的通路刺激子宮增生及DNA 合成[30], 卵巢和子宮中含有豐富的雌激素受體 ERα,在本實(shí)驗(yàn)中卵巢和子宮ERα的表達(dá)量均下降，可能與卵巢與子宮的損傷有關(guān)，重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激會(huì)對(duì)HPO軸帶來不良的影響，但對(duì)其反饋機(jī)制還不是很清楚，還需要進(jìn)一步探討。

本研究已證明重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激使得動(dòng)情周期延長(zhǎng)并造成卵巢和子宮的損傷，其可能是通過干擾HPO軸的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用，影響性激素的合成和分泌，從而損傷雌性動(dòng)物的性腺和生殖內(nèi)分泌功能。為改善和提高女性的生殖健康提出理論依據(jù)，并為防治女性生殖內(nèi)分泌疾病如月經(jīng)紊亂、性功能低下、更年期綜合征、閉經(jīng)等的藥物治療提供新的研究方向。