丙泊酚對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞激活的影響及其機(jī)制*

張倩璐，曠 昕

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，湖南 衡陽 421001)

肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是慢性肝臟疾病共同的病理特征，其主要的病理學(xué)特點(diǎn)包括肝臟組織內(nèi)結(jié)締組織和纖維組織的大量增生，細(xì)胞外基質(zhì)合成大于分解，細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，肝臟正常結(jié)構(gòu)被破壞和纖維結(jié)節(jié)形成等[1]。HF的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜至今尚未闡明清楚，研究發(fā)現(xiàn)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)的激活是HF形成的初始環(huán)節(jié)，在HF的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用[2]。參與HF形成的細(xì)胞外基質(zhì)主要來源于肝星狀細(xì)胞，轉(zhuǎn)化生長因子β 1(transforming growth factor β1, TGF-β1)是導(dǎo)致HSCs激活的重要因素，激活的HSCs也可大量分泌TGF-β1，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致HF的發(fā)生[3]。丙泊酚是目前主要的靜脈注射麻醉藥，其作用機(jī)制目前認(rèn)為是激活γ氨基丁酸(gamma aminobutyric acid, GABA)受體-氯離子復(fù)合物而發(fā)揮效應(yīng)[4]。丙泊酚具有誘導(dǎo)期短，起效快，蘇醒時(shí)間短，術(shù)后出現(xiàn)消化道副作用小等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于麻醉誘導(dǎo)和維持等[5]。研究顯示丙泊酚具有肝臟保護(hù)作用[6-7]，但其機(jī)制不清。因此該研究擬觀察丙泊酚對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞系HSC2-T6細(xì)胞激活的影響，并從哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)-自噬途徑的角度探討丙泊酚抑制肝星狀細(xì)胞的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠肝星狀細(xì)胞系HSC2-T6細(xì)胞(上海佳和生物科技有限公司)、DMEM培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)、小牛血清(中國杭州四季青公司)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1, TGF-β1)(美國Pedro Tech公司)、丙泊酚(propofol)、噻唑藍(lán)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)和雷帕霉素(美國Sigma公司)、兔抗鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)、Beclin 1、p62/SQSTM1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3A/B(microtubule-associated protein light chain-3 A/B, LC3 A/B)和GAPDH一抗及相應(yīng)的二抗(美國Santa Cruz公司)。BCA法蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)。透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)、IV型膠原(collagen IV, IV-C)和層粘連蛋白(laminin, LN)ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 肝星狀細(xì)胞的培養(yǎng)與分組

將肝星狀細(xì)胞系HSC2-T6細(xì)胞按密度為1×104cells/ml接種在75 cm2的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)在含小牛血清(10%)的DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃，含5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每隔一天更換培養(yǎng)液一次。處于對(duì)數(shù)生長期的HSC2-T6被用于后續(xù)的研究。細(xì)胞隨機(jī)地分為以下各組：對(duì)照組：用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HSC2-T6細(xì)胞24 h。TGF-β1組：用含TGF-β1(5 ng/ml)的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。丙泊酚組：用含丙泊酚(100 μmol/L)的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。TGF-β1+丙泊酚組：先用含丙泊酚(100 μmol/L)的培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h，再加入TGF-β1(5 ng/ml)共同繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。雷帕霉素組：用含雷帕霉素(5 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。TGF-β1+丙泊酚 + 雷帕霉素組：先用含雷帕霉素(5 μmol/L)DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h，用丙泊酚(100 μmol/L)處理1 h，然后再加入TGF-β1(5 ng/ml)繼續(xù)共同培養(yǎng)至24 h。每組設(shè)3個(gè)平行孔(n=3)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

在各處理因素到時(shí)間后，往每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入MTT工作液20 μl，再繼續(xù)孵育4 h。往每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中再加入150 μl 的DMSO，置于搖床上搖晃振蕩，時(shí)間定為10 min。設(shè)定酶標(biāo)儀波長至570 nm，然后測(cè)量各細(xì)胞培養(yǎng)孔的吸光度。MTT法用來檢測(cè)細(xì)胞活力的變化。

1.4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中HA、IV-C和LN的濃度

在各處理到時(shí)間后，吸出培養(yǎng)液，1 000 r/min離心10 min，收集上清。按照試劑盒的說明開展實(shí)驗(yàn)操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出細(xì)胞培養(yǎng)液上清中HA、IV-C和LN的濃度。ELISA法用來檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中HA、IV-C和LN濃度的變化。

1.5 透射電鏡檢測(cè) HSC2-T6細(xì)胞中自噬體等超微結(jié)構(gòu)

胰酶消化后，收集HSC2-T6細(xì)胞，加PBS清洗制成細(xì)胞懸液，3 000 r/min，離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀加入到戊二醛(2.5%)和鋨酸(1.9%)溶液中完成雙重固定。用不同濃度的丙酮溶液對(duì)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行逐級(jí)脫水。用樹脂包埋細(xì)胞團(tuán)。切片時(shí)切片厚度設(shè)定為50 nm，切片機(jī)進(jìn)行超薄切片。用檸檬酸鉛醋酸鈾溶液進(jìn)行雙重染色。在透射電鏡(H-7500型)下進(jìn)行觀察，并拍照保存結(jié)果。透射電鏡檢測(cè)用來觀察HSC2-T6細(xì)胞中自噬體形成等超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.6 Western blot檢測(cè)α-SMA、Beclin-1、LC-3、p62、mTOR和p-mTOR蛋白的表達(dá)

提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的總蛋白。采用BCA法測(cè)定樣本的蛋白濃度?？偟鞍讟颖炯尤爰訕泳彌_液中，煮沸充分變性蛋白質(zhì)。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的辦法將已變性蛋白分離，通過電轉(zhuǎn)移的辦法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinyl fluoride, PVDF)膜上。為了將非特異性抗原封閉通過脫脂牛奶(5%)在室溫下孵育PVDF膜2 h。加入鼠抗兔α-SMA(1∶500)、Beclin-1(1∶400)、LC-3(1∶300)、p62(1∶400)、mTOR(1∶400)、p-mTOR(1∶200)和GAPDH(1∶400)的一抗，4℃過夜。采用Tris-鹽酸緩沖鹽溶液清洗PVDF膜3次，然后加入二抗，繼續(xù)在4℃條件下孵育4 h，再通過Tris-鹽酸緩沖鹽溶液清洗PVDF膜3次。經(jīng)曝光、顯影、定影后，通過圖像分析軟件對(duì)膠片進(jìn)行掃描，以GAPDH作為內(nèi)參照，對(duì)目的蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。Western blot檢測(cè)用來觀察α-SMA、Beclin-1、LC-3、p62、mTOR和p-mTOR蛋白表達(dá)的變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚和TGF-β1(5 ng/ml)對(duì)HSC2-T6細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果如表1所示：TGF-β1組細(xì)胞中OD值較對(duì)照組顯著性增加(P<0.05)；丙泊酚+TGF-β1組OD值與TGF-β1組比較顯著性降低(P<0.05)。與對(duì)照組比較，丙泊酚組OD值沒有顯著性差異(P> 0.05)。

Tab. 1 Effects of propofol on the cell proliferation, secretion of extracellular matrix induced and activation of hepatic stellate cells by TGF-β1 in HSC2-T6 cells n=3)

2.2 丙泊酚對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化的影響

結(jié)果如圖1-A和表1所示：TGF-β1組細(xì)胞中α-SMA蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著性上調(diào)(P< 0.05)；丙泊酚+TGF-β1組細(xì)胞中α-SMA蛋白的表達(dá)水平與TGF-β1組比較顯著性下調(diào)(P<0.05)。與對(duì)照組比較，丙泊酚組細(xì)胞中α-SMA蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異(P>0.05)。分泌細(xì)胞外基質(zhì)是肝星狀細(xì)胞激活的重要特征，因此進(jìn)一步采用ELISA法測(cè)量培養(yǎng)液上清液中HA、IV-C和LN的濃度。結(jié)果如表1所示：TGF-β1組培養(yǎng)液上清中HA、IV-C和LN的濃度與對(duì)照組比較均明顯增加(P均<0.05)；丙泊酚+TGF-β1組培養(yǎng)液上清中HA、IV-C和LN的濃度與TGF-β1組比較均明顯降低(P均<0.05)。與對(duì)照組比較，丙泊酚組細(xì)胞中培養(yǎng)液上清中HA、IV-C和LN的濃度均沒有顯著性差異(P均>0.05)。

2.3 丙泊酚對(duì)TGFβ1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞自噬水平的影響

結(jié)果如圖1-B所示：對(duì)照組的HSC2-T6細(xì)胞中偶爾可見自噬體。TGF-β1組HSC2-T6細(xì)胞中自噬體與對(duì)照組相比較明顯增加(黑色箭頭所示)。丙泊酚+ TGF-β1組HSC2-T6細(xì)胞中自噬體與TGF-β1組比較均明顯減少。丙泊酚組HSC2-T6細(xì)胞中偶爾可發(fā)現(xiàn)自噬體。

進(jìn)一步觀察了肝星狀細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果如圖1-C和表2所示：TGF-β1組細(xì)胞中Beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較對(duì)照組顯著性上調(diào)，p62的蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著性下調(diào)(P均<0.05)；丙泊酚+TGF-β1組細(xì)胞中Beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與TGF-β1組比較顯著性下調(diào)，p62的蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著性上調(diào)(P均<0.05)。與對(duì)照組比較，丙泊酚組細(xì)胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ和p62的蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值沒有顯著性差異(P均>0.05)。

2.4 丙泊酚和TGF-β1對(duì)肝星狀細(xì)胞中mTOR和p-mTOR表達(dá)的影響

結(jié)果如圖1-D和表2所示：TGF-β1組細(xì)胞中p-mTOR和p-mTOR/mTOR比值較對(duì)照組均顯著性降低(P均<0.05)；丙泊酚+TGF-β1組細(xì)胞中p-mTOR和p-mTOR/mTOR比值與TGF-β1組比較均顯著性增加(P均<0.05)。mTOR的蛋白表達(dá)在對(duì)照組、丙泊酚組、TGF-β1組及丙泊酚+TGF-β1組之間沒有顯著性差異(P>0.05)。

Fig. 1 Effect of propofol on activation of hepatic stellate cells, autophagy and expressions of autophagy-related proteins, expression of mTOR and p-mTOR induced by TGF-β1 in HSC2-T6 cells

2.5 丙泊酚通過mTOR/自噬通路抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞的激活

進(jìn)一步證實(shí)mTOR/自噬通路參與丙泊酚抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞的激活，觀察mTOR抑制劑(自噬誘導(dǎo)劑)雷帕霉素對(duì)丙泊酚作用的影響。結(jié)果如圖2所示：與對(duì)照組比較，雷帕霉素組細(xì)胞中α-SMA蛋白顯著性增加(蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為100.00±7.86和154.73±11.56，P﹤0.05)。與丙泊酚+TGF-β1組比較，丙泊酚+TGF-β1+雷帕霉素組細(xì)胞中α-SMA蛋白顯著性增加(蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為132.75±15.84和176.11±17.22，P﹤0.05)，提示mTOR抑制劑雷帕霉素部分逆轉(zhuǎn)丙泊酚抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞激活的作用(表2)。

Fig. 2 Rapamycin reverses the inhibitory effect of propofol on the activation of hepatic stellate cells induced by TGF-β1 in HSC2-T6 cells n=3)

3 討論

丙泊酚是常用的靜脈麻醉藥，具有起效較快，持續(xù)輸注后沒有蓄積，其代謝受肝功能障礙的影響較小等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于各類手術(shù)的臨床麻醉。丙泊酚被認(rèn)為是通過激活抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的受體而發(fā)揮麻醉作用，近年來丙泊酚的非麻醉作用備受人們關(guān)注，特別是肝臟保護(hù)作用。王建珍等研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚聯(lián)合瑞芬太尼可以減輕肝硬化大鼠肝臟缺血/再灌注損傷，而其機(jī)制與調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，減少肝細(xì)胞凋亡有關(guān)[6]。張虹等的研究也發(fā)現(xiàn)丙泊酚可抑制H2O2誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞LO2的凋亡，而其作用機(jī)制可能是通過抑制Bda和Bax的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的[8]。Wei L等研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚對(duì)大鼠肝臟缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路[9]。本研究的結(jié)果顯示，TGF-β1處理HSC2-T6 24 h顯著增加細(xì)胞中α-SMA蛋白的表達(dá)、培養(yǎng)液上清中HA、IV-C和LN的濃度，表明TGF-β1誘導(dǎo)HSCs的激活，而給予丙泊酚處理顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC2-T6細(xì)胞的激活。因此本研究的結(jié)果提示丙泊酚對(duì)肝臟的保護(hù)作用可能是通過抑制HSCs激活而實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)也表明丙泊酚適用于肝功能有損傷的患者或其他肝臟手術(shù)的臨床麻醉。

Tab. 2 Effects of propofol on the expressions of autophagy-related proteins, mTOR and p-mTOR of hepatic stellate cells induced by TGF-β1 (%， n=3)

HF是由多種慢性肝損傷因素，如：酒精、毒物和乙肝病毒等長期作用的結(jié)果，是各種原因?qū)е碌母尾∠蚋斡不M(jìn)展的共同病理過程。HSCs的激活是HF發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。TGF-β1是引發(fā)HSCs激活的重要原因，在HF的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。TGF-β1主要由HSCs本身以及庫普弗細(xì)胞和肝竇的內(nèi)皮細(xì)胞分泌，通過與HSCs表面的TGF受體結(jié)合，激活Smad通路，促進(jìn)HSCs的激活[10]。激活后的HSCs在細(xì)胞形態(tài)和功能上都發(fā)生較大的變化，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，并表達(dá)肌原性標(biāo)志蛋白，如α-SMA等，大量分泌HA、IV-C和LN等細(xì)胞外基質(zhì)[11]。細(xì)胞增殖也是HSCs激活的重要特點(diǎn)之一[12]。

自噬是一種通過溶酶體的作用來降解細(xì)胞內(nèi)的錯(cuò)誤折疊的蛋白、長壽蛋白質(zhì)、損傷的細(xì)胞器和病原微生物的生物過程，是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要代謝途徑[13]。多種蛋白參與自噬的全過程，在自噬的起始環(huán)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用的是Beclin-1，促進(jìn)自噬體的形成，被認(rèn)為是自噬體形成的標(biāo)志物[14]。在自噬被激活后，LC3從胞質(zhì)型LC3-I轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合在自噬體膜上的LC3-II，形成具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。因此，Beclin-1和LC3-II的表達(dá)水平以及LC3-II/LC3-I的比值常用來反映自噬的水平。在自噬體形成后，p62與LC3-II蛋白相結(jié)合形成復(fù)合物，并可與選擇性底物相互結(jié)合，最終會(huì)在溶酶體內(nèi)降解，因此p62被認(rèn)為是自噬的底物，p62水平的增加通常表示自噬體與溶酶體的結(jié)合并最終導(dǎo)致降解的過程受到損傷[15]。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)整合參與調(diào)節(jié)自噬相關(guān)信號(hào)的中樞，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中自噬的主要上游負(fù)性調(diào)控因子[16]。研究顯示肝星狀細(xì)胞的自噬介導(dǎo)其激活[17-18]。本研究結(jié)果顯示丙泊酚抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC2-T6細(xì)胞中自噬體數(shù)量、Beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的增加，以及p-mTOR蛋白表達(dá)、p-mTOR/mTOR比值及p62蛋白表達(dá)的降低，而mTOR抑制劑雷帕霉素部分逆轉(zhuǎn)丙泊酚抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞激活的作用。以上結(jié)果提示丙泊酚抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞的激活，其機(jī)制可能是通過激活mTOR信號(hào)而抑制自噬實(shí)現(xiàn)的。目前丙泊酚對(duì)自噬的影響較復(fù)雜，還存在矛盾的結(jié)果。Wang H等研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可通過抑制JNK的活化，抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞自噬[19]，這與我們的結(jié)果是一致的。但Qiao H等研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可誘導(dǎo)神經(jīng)祖細(xì)胞的自噬[20]。這些矛盾的結(jié)果可能與細(xì)胞的種類不同有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明丙泊酚抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞的激活，其作用機(jī)制可能與丙泊酚激活mTOR信號(hào)而抑制自噬有關(guān)，為以肝星狀細(xì)胞的激活為重要基礎(chǔ)的HF的防治提供新的思路和策略，也為拓寬丙泊酚的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為臨床肝硬化和肝炎等肝功能受損患者的麻醉用藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。