有機磷阻燃劑TDCIPP對雌性大鼠甲狀腺的潛在毒性作用*

孫景然，樊禰禰，張 楨，吳 瑾，韓殿鵬，白家磊，杜連群，房彥軍 △

(1. 軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050； 2. 中北大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太原 030051)

隨著溴代阻燃劑(brominated flame retardants, BFR)在全球范圍內(nèi)的限制使用，作為替代品的三(2-氯乙基)磷酸酯(tris(2-chloroethyl) phosphate, TDCIPP)有機磷酸脂阻燃劑，已被多個生產(chǎn)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[1]。有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在水、大氣、土壤、室內(nèi)灰塵等各類環(huán)境介質(zhì)中，甚至人類尿樣、脂肪組織、乳汁中均可以檢測到TDCIPP[1, 2]。目前環(huán)境中TDCIPP的暴露濃度已經(jīng)開始危害人類的健康，越來越多的調(diào)查顯示，有機磷酸酯類阻燃劑由于其不易降解、容易在生物體內(nèi)富集等原因，已經(jīng)開始威脅到生態(tài)環(huán)境的安全及人類的健康，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)該類新型阻燃劑具有內(nèi)分泌毒性、甲狀腺毒性、神經(jīng)毒性和潛在致癌性[2]。本研究采用經(jīng)口灌胃的體內(nèi)染毒方式建立TDCIPP暴露動物模型，通過檢測甲狀腺組織的病理變化及甲狀腺激素水平的改變來探討TDCIPP對甲狀腺的毒性作用，為更好的評價TDCIPP毒性作用機制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

將32只離乳3周的雌性SD大鼠隨機分為4組：對照組(玉米油灌胃)、TDCIPP溶解于玉米油中，分為低劑量組(50 mg/(kg·d))、中劑量組(100 mg/(kg·d))、高劑量組(250 mg/(kg·d))，每組8只, 連續(xù)灌胃給藥21 d，每天1次。末次給藥后處死動物，取血后分別取出甲狀腺和肝組織備用。

1.2 儀器與試劑

光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，日本)，低溫高速冷凍離心機(ASONE，日本)，PCR擴增儀(ABIPrism，USA)，ABI7300熒光定量PCR儀(ABIPrism，USA)，紫外凝膠成像系統(tǒng)(Microvision，USA)；甲狀腺激素TT3、TT4、FT4、TSH試劑盒(北京北方生物研究所，中國)，RNase-free DNase I試劑盒(TaKaRa，日本)，BCA蛋白定量試劑盒(碧云天，中國)，TDCIPP(Sigma美國)，兔抗CYP3A1抗體、兔抗UGT1A6抗體 、兔抗TTR抗體、兔抗TRβ抗體(Abcam，UK)

1.3 甲狀腺臟器系(指)數(shù)測定

動物處死后，立刻摘除甲狀腺，生理鹽水沖洗干凈后用濾紙吸干殘留液體并稱重記錄。質(zhì)量都精確到0.1 g。甲狀腺絕對質(zhì)量= 甲狀腺質(zhì)量/動物質(zhì)量

1.4 甲狀腺組織的病理變化

甲狀腺被摘除后，用10%的福爾馬林液體固定至少48 h，然后用石蠟包埋，切片厚度約為4～5 μm，用蘇木素和伊紅進行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變并拍照。

1.5 甲狀腺激素的改變

在末次給藥結(jié)束后，用7%的水合氯醛(注射劑量為0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉動物，主動脈取血，3 000 r/min離心10 min，收集上清液于-80℃冷凍。血清三碘甲腺原氨酸(3,3’,5-triiodothyronine，T3)，四碘甲腺原氨酸(3,3’,5,5’-tetraiodothyronine，T4)，游離T4(free 3,3’,5,5’-tetraiodothyronine，F(xiàn)T4)和促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)濃度使用大鼠特異的ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒進行測量。

1.6 RNA提取和RT-PCR分析

稱取適量的甲狀腺組織，加入液氮和一定比例的TRIZOL試劑研磨。4℃離心機，12 000 r/min離心15 min，取上層無色水相層(含RNA)再加入等體積異丙醇，12 000 r/min離心10 min后獲取RNA。用1 ml 75%乙醇清洗RNA沉淀1次后用20 μl DEPC水溶解，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。提取的RNA純度和質(zhì)量分別利用紫外分光光度計測量A260/280 nm波長吸光值比值和EB染色的1%的瓊脂糖凝膠電泳實驗驗證。第一鏈cDNA合成使用TaKaRa公司的Prime Script RT試劑盒，按照試劑盒說明使用。RT-PCR使用SYBR Real-time PCR Master-Mix-Plus試劑盒以及ABI7300PCR儀器進行，反應(yīng)體系配備和反應(yīng)過程詳見說明書。所有RT-PCR數(shù)據(jù)均使用2-ΔΔCT方法進行處理。目的基因引物序列如表1所示。

Tab. 1 Primer sequences used for RT-PCR

1.7 蛋白提取和Western blot電泳

新鮮肝臟組織(200 mg)液氮研磨，加入含有蛋白酶抑制劑PMSF的組織裂解液RIPA試劑進行勻漿裂解。然后在4℃離心14 000 r/min離心10 min。蛋白濃度使用碧云天公司的BCA蛋白定量試劑盒進行定量。定量后的蛋白樣品加入1/5樣品體積的6×loading buffer(pH 6.8)，100℃煮沸10 min。4℃，12 000 r/min離心10 min，靜置備用。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜后，抗體孵育(抗體種類見1.2)后，在暗室中進行顯色。使用紫外凝膠成像系統(tǒng)(Microvision，USA)進行成像分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重和甲狀腺組織質(zhì)量的變化

與對照組比較，各個TDCIPP劑量組大鼠的體重?zé)o明顯變化。稱取甲狀腺組織獲得其絕對質(zhì)量，通過公式甲狀腺相對質(zhì)量=甲狀腺絕對質(zhì)量/大鼠質(zhì)量，在中劑量組和高劑量組，大鼠甲狀腺的絕對和相對質(zhì)量出現(xiàn)明顯的增大，且呈劑量依賴性變化(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Changes of rats’ body and thyroid n=8)

2.2 甲狀腺的組織病理變化

HE染色結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)TDCIPP染毒組大鼠甲狀腺出現(xiàn)不同程度的病理損傷。在對照組中，甲狀腺濾泡由立方形上皮細胞組成并充滿膠質(zhì)，所有濾泡細胞均整齊規(guī)則排列。低劑量組組織學(xué)未出現(xiàn)明顯變化。而中、高劑量組大鼠的甲狀腺組織切片中，濾泡細胞排列不規(guī)則，膠質(zhì)較少，濾泡有增生和肥大現(xiàn)象，尤其是高劑量組中，濾泡增生嚴(yán)重，部分甚至缺少膠質(zhì)。四組甲狀腺細胞核均未見有異常病變(圖1)。

Fig. 1 Changes of rats thyroid induced by TDCIPP(HE ×400)

2.3 甲狀腺激素的變化

血清TSH水平在低劑量組TSH的平均水平明顯低于對照組(P<0.05)，中劑量組與高劑量組TSH未出現(xiàn)明顯變化，T3在高劑量組水平顯著升高(P<0.05)，其他各組與對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異。三個TDCIPP暴露組中血清T4和FT4水平與對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異(圖2)。

Fig. 2 Changes of thyroxine induced by TDCIPP(n=8)

2.4 與甲狀腺激素相關(guān)基因表達的變化

利用RT-PCR技術(shù)檢測與甲狀腺激素合成及轉(zhuǎn)運相關(guān)的11個基因。其中有4個與甲狀腺激素合成相關(guān)的基因：鈉碘轉(zhuǎn)運體(sodium iodide symporter, NIS),甲狀腺過氧化物酶(thyroperoxidase, TPO),甲狀腺球蛋白(thyroglobulin, Tg)和促甲狀腺激素受體(thyroid stimulating hormone receptor, TSHR)作為目的基因來研究TDCIPP暴露是否能夠影響大鼠甲狀腺激素合成。結(jié)果顯示：與對照組比較，三個TDCIPP暴露組中TPO mRNA水平的表達均高于對照組，其中中、高劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，P<0.01)。NIS和TG mRNA表達在低、中劑量組無明顯差異，但在高劑量暴露組，二者表達顯著高于對照組(P<0.05)。TSHr基因表達在低劑量暴露組明顯下調(diào)(P<0.01)，而在中劑量和高劑量組，TSHR表達卻呈現(xiàn)出恢復(fù)到對照水平的趨勢(圖3)。

Fig. 3 Changes of gene expressions in thyroid tissue induced by TDCIPP(n=8)

有7個甲狀腺激素轉(zhuǎn)運基因：轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin, TTR)、甲狀腺激素生物基因轉(zhuǎn)化脫碘酶1(type 1 deiodinase, DIO1)、排泄基因(udp-glucuronosyl-transferase-1A1, 1A6; UGT1A1, UGT1A6)，甲狀腺激素受體(TRα和 TRβ)以及毒物代謝基因CYP4503A1(cytochrome-p450-3A1 )被選為目的基因用于研究TDCIPP暴露對大鼠甲狀腺功能的影響。在被測的7個目的基因中，僅有4個基因出現(xiàn)有意義的改變。與對照組相比，CYP3A1基因和UGT1A6基因在三個暴露組顯著上調(diào)，尤其在高劑量組明顯，兩基因分別上調(diào)3.7倍和2.3倍(P<0.05)。DIO1基因的表達在高劑量組上調(diào)1.6倍(P<0.05)。TRβ mRNA表達水平均低于對照組，但只有在高劑量組才具有統(tǒng)計學(xué)意義，下調(diào)約51%(P<0.05，圖4)。另外三個目的基因(UGT1A1, TTR, and TRα)均未發(fā)現(xiàn)有意義的改變。

Fig. 4 Changes of genes correlate with thyroid induced by TDCIPP(n=8)

2.5 與甲狀腺素相關(guān)蛋白的改變

運用Western blot 技術(shù)檢測肝臟與甲狀腺素生成相關(guān)的四個目的蛋白(TRβ，TTR, UGT1A6 and CYP3A1)，選用GAPDH為內(nèi)參蛋白。實驗結(jié)果表明，與對照組比較，肝臟組織中TRβ蛋白表達呈現(xiàn)劑量依賴性下降趨勢，中、高劑量組TRβ蛋白表達分別下降0.83倍和0.65倍，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。與TRβ蛋白表達趨勢相反，肝臟組織中UGT1A6和CYP3A1蛋白表達水平呈現(xiàn)出有統(tǒng)計學(xué)意義的劑量依賴性上調(diào)趨勢。與對照相比，其中UGT1A6分別上調(diào)1.4、1.65和1.8倍，CYP3A1分別上調(diào)1.4、2.4和3.3倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。TTR蛋白表達并未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義變化(圖5)。

3 討論

甲狀腺是人體最大的內(nèi)分泌腺體，具有維持調(diào)節(jié)人體正常體溫、促進發(fā)育、調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝等作用。因此，甲狀腺結(jié)構(gòu)及功能的改變會涉及到體內(nèi)甲狀腺激素水平的變化，從而影響正常的集體功能[3]。

Fig. 5 Changes of proteins correlate with thyroid induced by TDCIPP in rat liver tissue (n=8)

本研究結(jié)果表明在TDCIPP的暴露下，低劑量組血清TSH水平明顯降低，導(dǎo)致甲狀腺激素分泌減少，從而引起血清中T3，T4水平下降趨勢。然而血清TSH水平在高劑量組又明顯升高?？赡苁怯捎诘蛣┝縏DCIPP暴露下大鼠血清T3和T4水平下降，而低水平的甲狀腺激素循環(huán)負(fù)反饋調(diào)節(jié)下丘腦產(chǎn)生TRH，TRH作用于垂體使其釋放TSH，因此TSH低劑量組升高。在TSH的持續(xù)刺激下，導(dǎo)致甲狀腺出現(xiàn)增生等病理性改變；增生的甲狀腺濾泡上皮細胞反過來又產(chǎn)生甲狀腺激素。因此中、高劑量組的TSH的水平相對又有升高的表現(xiàn)，而T3水平在高劑量組出現(xiàn)顯著性升高，這與TDCIPP暴露的斑馬魚模型中，血清T3水平升高，T4水平下降；雞胚胎經(jīng)過一定劑量TDCIPP處理后，同樣降低血清T4水平，但不改變T3水平相似[4]。本研究中各劑量組大鼠的血清T4和FT4水平與對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義，這與Moser等指出TDCIPP染毒的孕期Long-Evans 大鼠及其所產(chǎn)仔鼠血清T3和T4水平均未發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)意義的改變基本一致[5]。

甲狀腺組織中，三個TDCIPP暴露組中TPO mRNA和蛋白水平的表達均高于對照組，NIS和TG mRNA表達在高劑量暴露組表達顯著高于對照組。這可能是由于在TDCIPP的持續(xù)刺激下，甲狀腺激素不能夠滿足機體需求時，甲狀腺組織代償需要，NIS、TG、TPO基因表達增多，以合成更多的甲狀腺激素來滿足機體的需要。另外與甲狀腺激素水平相關(guān)的幾個基因中，CYP3A基因編碼單氧化酶類，該類酶能夠催化外源化合物以及內(nèi)源性膽固醇，UGT1A基因與肝臟代謝，甲狀腺激素的膽汁清除密切相關(guān)[6]。這與此前報道TDCIPP暴露改變?nèi)斯づ囵B(yǎng)雞的胚胎和肝細胞中CYP3A37, CYP2C45,UGT1A1 和UGT1A9基因的表達基本一致。在TDCIPP暴露下，機體T3和T4水平降低，引起與甲狀腺TRβ受體相關(guān)通路的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答降低有關(guān)。這與TDCIPP暴露能夠引起斑馬魚甲狀腺TRα受體相關(guān)通路的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答有關(guān)報道一致[7]，具體機制有待進一步研究。

總之, TDCIPP短期暴露可以對大鼠引起的潛在甲狀腺毒性效應(yīng)，上調(diào)細胞色素酶CYP3A1、葡糖苷酸轉(zhuǎn)運酶UGT1A6基因和蛋白、脫碘酶DIO1基因表達，造成血清甲狀腺激素T4和FT4下降趨勢，甲狀腺組織增生作為一種代償機制，又會上調(diào)TG、NIS、TPO基因和蛋白的表達以便合成足夠的甲狀腺素，維持甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)，保障機體正常生理功能。具體的過程和機制還有待于進一步研究。