硫氫化鈉對(duì)脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型小鼠海馬MBP及學(xué)習(xí)記憶的影響*

姜洪波，董家行，秦玉飛，劉佳聰，姜萬(wàn)舉，李若男，劉嵐慈，田一丹，許予明，杜愛(ài)林，Δ

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000； 2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，中英腦功能損傷聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南省高校腦研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，河南 新鄉(xiāng) 453000； 3. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

SCA3(spinocerebellar ataxia type3，脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型)是累及人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)的主要遺傳退行性疾病之一，是常染色體顯性遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)最常見(jiàn)亞型，在中國(guó)的患病率約為3～5/10萬(wàn)，主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的小腦性共濟(jì)失調(diào)、步態(tài)不穩(wěn)、動(dòng)作笨拙，可伴有眼球震顫，吞咽障礙以及感覺(jué)異常等[1]，研究表明：記憶力、認(rèn)知力降低與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)有髓神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)的改變有著密切的聯(lián)系。CNS髓鞘的主要成分之一髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)能夠維持CNS髓鞘結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定、維持腦發(fā)育[2]，且髓鞘內(nèi)MBP的正常表達(dá)依賴于線粒體的正常能量供應(yīng)。研究表明，在SCA3發(fā)病機(jī)制中線粒體損傷也發(fā)揮重要作用[3]，線粒體損傷會(huì)導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞ATP合成障礙，并進(jìn)一步導(dǎo)致MBP的降低及髓鞘損傷。

H2S具有調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌功能和抗神經(jīng)毒性的作用，并通過(guò)減輕氧化損傷、上調(diào)自噬和維持蛋白穩(wěn)態(tài)等來(lái)保證神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能[4]。研究表明H2S能拮抗血管性癡呆患者海馬神經(jīng)元的凋亡過(guò)程[5]。此外，H2S對(duì)學(xué)習(xí)和記憶也有重要的調(diào)節(jié)作用[6]，能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生、保護(hù)線粒體[7]。因此推測(cè)通過(guò)改變SCA3小鼠海馬內(nèi)硫化氫的含量很可能改善其線粒體功能，進(jìn)而使MBP含量增加來(lái)減輕海馬髓鞘損傷，并進(jìn)一步改善SCA3小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙[8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較SCA3小鼠和野生型(Wild Type，WT)小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能、海馬內(nèi)硫化氫含量和MBP的表達(dá)差異，探討不同濃度的外源性硫氫化鈉對(duì)SCA3的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及SCA3小鼠的鑒定

雄性SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠和雄性野生型小鼠(wild type，WT)均來(lái)源于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重20～23 g，月齡12個(gè)月。SCA3小鼠的鑒定引物共3對(duì)，共用上游引物，下游引物有三條，選擇其中之一即可，其中引物SCA3-Ide-F / SCA3-Ide-R1較穩(wěn)定。若為SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠，則在選用引物SCA3-Ide-R1鑒定時(shí)，會(huì)擴(kuò)增儲(chǔ)500 bp大小的特異性片段，若為野生型正常小鼠則擴(kuò)增不出特異片段(表1)。

Tab. 1 Primers for identification of SCA 3 mice

1.2 模型建立

將60只12月齡雄性小鼠進(jìn)行分組，12只WT小鼠組每日腹腔注射等量生理鹽水做為正常對(duì)照組(NC Group)，48只SCA3小鼠隨機(jī)分為模型組(M Group)，NaHS低劑量組(NL Group，NaHS 10 μmol/kg)、NaHS中劑量組(NM Group，NaHS 50 μmol/kg)和NaHS高劑量組(NH Group，NaHS 100 μmol/kg)。實(shí)驗(yàn)持續(xù)28 d，期間每周監(jiān)測(cè)小鼠的體重，并根據(jù)小鼠體重的改變相應(yīng)調(diào)整給藥量。

1.3 水迷宮測(cè)試

1.3.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 游泳池水溫調(diào)整至22～24℃再開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。把無(wú)毒的白色涂料加入到水池內(nèi)，目的是使水變得不透明，水下平臺(tái)低至水面下0.5 cm。Morris水迷宮初篩是實(shí)驗(yàn)前從所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中篩選出會(huì)游泳且游泳速度、反應(yīng)時(shí)間合適的小鼠。定位航行實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行4 d，每天改變游泳小鼠的開(kāi)始象限，改變方向?yàn)槟鏁r(shí)針。具體步驟參考杜愛(ài)林[9]等的研究。

1.3.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 為檢測(cè)小鼠在空間記憶形成后的定位保持能力，于定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后進(jìn)行一次空間探索實(shí)驗(yàn)。具體步驟參考杜愛(ài)林[10]等的研究。

1.4 標(biāo)本的固定取材和制作部分

每組隨機(jī)挑選8只小鼠，用4%多聚甲醛經(jīng)左心室灌注后完整取出其腦組織，并及時(shí)進(jìn)行固定，脫水，石蠟包埋等步驟，制成石蠟切片，用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。剩余小鼠處死后完整取出其腦組織，并分離出雙側(cè)海馬，均放入液氮保存，用于海馬的硫化氫含量的測(cè)定和電鏡觀察。

1.5 測(cè)定小鼠海馬組織H2S含量

用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)670 nm測(cè)定吸光度，同時(shí)使用分光光度法間接測(cè)定海馬中H2S含量。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照倪云成[10]等的研究。

1.6 測(cè)小鼠海馬區(qū)域MBP的表達(dá)情況

取制備好的石蠟切片，進(jìn)行抗原修復(fù)和免疫組化，DAB顯色，顯微鏡觀察并攝片。用image-pro-plus 6.0 圖像處理軟件對(duì)MBP的陽(yáng)性表達(dá)情況進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并判斷MBP的陽(yáng)性表達(dá)情況。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照徐磊[11]等的研究。

1.7 電鏡觀察小鼠海馬

取小鼠海馬組織，體積約1 mm3，取材后在1 min內(nèi)用4%戊二醛固定，進(jìn)行脫水包埋切片染色，電鏡觀測(cè)并攝片，觀察海馬神經(jīng)元髓鞘超微結(jié)構(gòu)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SCA3小鼠的鑒定

我們通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)鑒定SCA3小鼠基因型，SCA3小鼠在500 bp片段左右會(huì)出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增，而這個(gè)片段在野生型小鼠中沒(méi)有擴(kuò)增。圖中顯示樣品具有500 bp片段，因此樣本1、4、5和6來(lái)源于SCA3小鼠，而樣本2和3則來(lái)源于野生型小鼠(圖1)。

Fig. 1 Analysis of PCR products of SCA3-Ide-R1 amplified from mice

2.2 Morris水迷宮

2.2.1 NaHS對(duì)游行距離的影響 4 d的Morris水迷宮訓(xùn)練試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示，12月齡模型組(M)SCA3小鼠的平均行駛距離較同齡對(duì)照組(NC)的WT小鼠明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，這表明SCA3小鼠的學(xué)習(xí)記憶存在一定障礙，也證明SCA3模型小鼠造模成功；而經(jīng)過(guò)不同劑量NaHS治療后(低、中、高劑量)的12月齡小鼠與模型組(M)SCA3小鼠相比，平均行駛距離有不同程度的縮短，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示外源性的NaHS能夠改善SCA3小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

2.2.2 NaHS對(duì)平臺(tái)潛伏期的影響 Morris水迷宮平均平臺(tái)潛伏期結(jié)果顯示，12月齡的模型組(M)SCA3小鼠較同齡對(duì)照組(NC)WT小鼠明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；而經(jīng)過(guò)外源性的NaHS治療后，與模型組SCA3小鼠相比，NaHS各劑量組(低、中、高劑量)小鼠的平均平臺(tái)潛伏期明顯縮短(P<0.05)，再次證明NaHS能顯著改善SCA3小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

2.2.3 NaHS對(duì)游泳速度的影響 水迷宮的游泳速度數(shù)據(jù)顯示，12月齡的對(duì)照組(NC)WT小鼠組和SCA3小鼠之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，同樣12月齡NaHS組小鼠(低、中、高劑量)和模型組(M)SCA3小鼠間也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表2)。

Tab. 2 The distance, latency and swimming velocity of mice in n=12)

2.3 各組小鼠海馬H2S含量及有髓神經(jīng)纖維MBP的表達(dá)

結(jié)果如表3所示，與正常對(duì)照組(NC)相比，模型組(M)SCA3小鼠海馬區(qū)域H2S含量明顯降低(P<0.01)；在給予NaHS干預(yù)后，NaHS低劑量小鼠組(NL)與模型組(M)SCA3小鼠比較，海馬組織H2S濃度雖然升高，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；而NaHS中劑量組(NM)和NaHS高劑量組(NH)小鼠與模型組(M)SCA3小鼠比較，海馬組織H2S含量均顯著增加(P均<0.01)。

模型組(M)SCA3小鼠與正常對(duì)照組(NC)相比，海馬有髓神經(jīng)纖維MBP平均光密度明顯降低，絲狀著色減少(P<0.05)；在給予NaHS干預(yù)后，NaHS低、中、高劑量組小鼠(NL、NM和NH)與模型組(M)SCA3小鼠比較，海馬有髓神經(jīng)纖維MBP平均光密度均升高，絲狀著色增加(P<0.05，圖2) 。

Tab. 3 The contents of H2S and MBP in the SCA3 mice with NaHS n=8)

Fig. 2 MBP mean optical density of hippocampal myelinated nerve fibers

2.4 各組小鼠海馬軸突髓鞘的變化

正常對(duì)照組(NC)小鼠海馬軸突被厚厚的髓鞘包繞，髓鞘板層致密，完整，且邊界清晰(圖3)；而模型組SCA3小鼠的海馬髓鞘板層排列松散，紊亂，軸索出現(xiàn)間隙；提示SCA3小鼠的神經(jīng)元髓鞘很可能存在一定的損傷；而經(jīng)不同濃度的NaHS干預(yù)后，海馬軸突髓鞘版層松散逐漸減少，分布趨向規(guī)則。

Fig. 3 Electron microscopy of hippocampal myelin

3 討論

SCA3是一種神經(jīng)退行性疾病，患者有不同程度的認(rèn)知功能障礙[12]，目前尚無(wú)良好的治療方法。H2S是一種新型的調(diào)節(jié)因子和信號(hào)傳遞分子，在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，被稱(chēng)為繼CO和NO后的第三種氣體信號(hào)分子[13]。 H2S具有多種生理功能，包括調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)與記憶、降低組織與細(xì)胞有氧氧化水平、激活血管平滑肌KATP通道造成血管舒張等[14]。并且能通過(guò)下丘腦-垂體-腎上腺軸來(lái)參與神經(jīng)內(nèi)分泌功能的調(diào)節(jié)[15]，保護(hù)機(jī)體理化環(huán)境穩(wěn)定，還具有抗神經(jīng)毒性作用，保證神經(jīng)系統(tǒng)功能的正常。在機(jī)體生理濃度范圍內(nèi)，H2S作為CNS一種重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)磷腺苷(cAMP)的水平提高神經(jīng)元N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸(NMDA)受體調(diào)節(jié)的反應(yīng)，易化海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)的產(chǎn)生，對(duì)學(xué)習(xí)、記憶發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能[16]并且有研究表明生理濃度的H2S通過(guò)激活線粒體KATP改善線粒體的呼吸功能、提高膜電位、增加能量的產(chǎn)生;抑制Ca2+超載對(duì)線粒體起到保護(hù)作用[16]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，MBP是由少突膠質(zhì)細(xì)胞合成，是組成髓鞘的主要成分之一，因此常被作為特異性生化指標(biāo)來(lái)判斷有無(wú)髓鞘的脫失[17]，有研究表明：中樞神經(jīng)系統(tǒng)有髓神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)的改變與認(rèn)知、記憶功能降低存在密切的關(guān)系[18]。所以通過(guò)調(diào)節(jié)海馬內(nèi)H2S水平改變MBP含量可能作為治療SCA3發(fā)病時(shí)記憶力障礙的一種思路。

本實(shí)驗(yàn)中分別測(cè)定各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、海馬內(nèi)H2S、有髓神經(jīng)纖維MBP的含量以及電鏡觀察海馬髓鞘結(jié)構(gòu)。據(jù)Morris水迷宮結(jié)果顯示，SCA3小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯低于正常野生型小鼠，經(jīng)過(guò)NaHS治療后，SCA3小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力得到一定改善。通過(guò)免疫組化的方法測(cè)出SCA3小鼠的大腦海馬內(nèi)有髓神經(jīng)纖維通路的MBP含量明顯低于WT小鼠，說(shuō)明海馬內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的MBP含量與SCA3小鼠生長(zhǎng)過(guò)程中的空間學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)[19]，經(jīng)過(guò)NaHS治療后，MBP平均光密度升高，絲狀著色增加，含量升高。H2S含量測(cè)定結(jié)果顯示與正常野生型小鼠對(duì)比，SCA3模型組小鼠腦內(nèi)的H2S含量明顯低于WT小鼠，經(jīng)過(guò)NaHS治療后，海馬組織H2S含量顯著增加。通過(guò)電鏡拍攝海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組小鼠相比，SCA3小鼠的海馬髓鞘板層排列松散，紊亂，軸索出現(xiàn)間隙，提示SCA3小鼠的神經(jīng)元髓鞘很可能存在一定的損傷，然而經(jīng)過(guò)NaHS治療后，SCA3小鼠腦內(nèi)的H2S含量顯著提升到正常水平附近，髓鞘板層結(jié)構(gòu)也有明顯的改善。

研究結(jié)果表明SCA3小鼠記憶功能障礙可能是由于其海馬內(nèi)有髓神經(jīng)纖維通路MBP含量的降低引起的，H2S對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善也是通過(guò)上調(diào)海馬內(nèi)有髓神經(jīng)纖維通路MBP的含量。然而，這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)只研究小鼠SCA3模型的12月齡的學(xué)習(xí)和記憶發(fā)展和H2S關(guān)系，仍需要研究不同月齡SCA3小鼠海馬內(nèi)H2S含量與學(xué)習(xí)和記憶關(guān)系以及詳細(xì)的神經(jīng)回路，包括其效應(yīng)及H2S對(duì)SCA3的學(xué)習(xí)和記憶的影響。

綜上所述，硫氫化鈉治療SCA3小鼠的機(jī)制可能是硫氫化鈉作為H2S的前體物質(zhì)，通過(guò)上調(diào)海馬內(nèi)H2S的含量，使海馬有髓神經(jīng)纖維通路MBP含量增加來(lái)減輕其髓鞘損傷，從而改善SCA3小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。外源性硫氫化鈉可能會(huì)改變SCA3患者海馬的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，而這將為臨床SCA3患者的營(yíng)養(yǎng)支持與治療提供新的方向。