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    組蛋白乙?;瘜λダ洗剖笈咛グl(fā)育影響的研究

    2018-07-24 10:27:42徐堯
    科技創(chuàng)新與品牌 2018年5期
    關(guān)鍵詞:雌鼠年老乙?;?/a>

    徐堯

    1 前言

    隨著晚婚晚育政策的推行以及“二胎政策”的放開,生殖健康越來越成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。衰老的卵子會帶來包括流產(chǎn)在內(nèi)的一系列問題,通過對衰老卵子影響因素的研究,我們可以更好地對卵子質(zhì)量進(jìn)行調(diào)控,提高生殖健康能力。

    為進(jìn)一步探索與卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)的年齡的相關(guān)因素,我們在實(shí)驗(yàn)室比較了年輕C57BL/6雌鼠(5周)與45周雌鼠的MII卵母細(xì)胞的mRNA的各個基因表達(dá)量。通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn),接近5%的母源物質(zhì)受到了年齡增長的影響。有趣的是,有很多與表觀修飾相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本受到了年齡增長的嚴(yán)重影響,例如DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶、組蛋白乙?;傅取?/p>

    我們的研究是通過比較不同年齡雌鼠的受精胚胎的發(fā)育能力發(fā)現(xiàn)衰老雌鼠的生殖能力出現(xiàn)明顯下降,并出現(xiàn)流產(chǎn)、妊娠率低等現(xiàn)象。該研究通過在體內(nèi)和體外模擬方式明確了乙?;呤锹涯讣?xì)胞衰老造成動物流產(chǎn)、妊娠率低的一個重要原因,并且乙酰化的升高改變了眾多基因的表達(dá),從而為人們提高對卵母細(xì)胞衰老認(rèn)識、進(jìn)行胚胎質(zhì)量控制提供重要的證據(jù)。

    2 方法

    2.1 CD-1雌鼠受精卵的獲取

    我們選取了 8~10周齡的CD-1雌鼠獲取受精卵和實(shí)驗(yàn)用卵母細(xì)胞。

    2.2體外TSA處理

    通過對實(shí)驗(yàn)受體分別做添加去乙?;敢种苿㏕SA,和不加TSA處理,放入胚胎培養(yǎng)箱觀察發(fā)育。囊胚后移植至假孕體內(nèi)觀察體內(nèi)發(fā)育。

    2.3 假孕雌鼠的制備

    挑選健康8周齡左右性成熟雌性CD-1品系雌鼠,與同品系輸精管結(jié)扎公鼠合籠交配。之后通過檢栓,挑選出假孕雌鼠。

    2.4 雌鼠胚胎移植

    對雌鼠進(jìn)行全身麻醉后,將要移植的囊胚注入假孕鼠輸卵管膨大部中。

    2.5 免疫熒光染色

    將要染色的胚胎,按流程進(jìn)行清洗、染色。

    2.2.6 PCR檢測

    按配方進(jìn)行PCR鑒定。

    3 數(shù)據(jù)分析

    3.1 衰老雌鼠生殖能力下降

    3.1.1衰老雌鼠受精卵質(zhì)量差

    我們選取6周和14個月大的CD-1雌鼠作為研究對象。通過超數(shù)排卵的手段對兩種雌性雌鼠進(jìn)行激素調(diào)節(jié),隨后在注射完HCG后,將超數(shù)排卵的雌鼠與雄鼠進(jìn)行合籠,利用輸卵管沖洗的辦法取出受精卵。通過在高倍光鏡下檢測,我們發(fā)現(xiàn)衰老雌鼠的受精卵胞質(zhì)發(fā)黑,并呈顆?;?。該結(jié)果說明受精卵的質(zhì)量隨著雌鼠年齡的增長而變差。

    3.1.2衰老雌鼠早期胚胎發(fā)育效率低下

    我們分別取年輕雌鼠(8周)和衰老雌鼠(14月)的受精卵進(jìn)行體外培養(yǎng)觀察。我們發(fā)現(xiàn)衰老雌鼠的胚胎發(fā)育率隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多,逐漸下降(圖3-1)。囊胚率約為年輕雌鼠的一半。該結(jié)果表明隨著雌鼠年齡的增長,雌鼠早期胚胎發(fā)育能力下降。

    3.1.3衰老雌鼠胚胎具有妊娠率低并出現(xiàn)胎兒流產(chǎn)畸形的特點(diǎn)

    為了更好地排除衰老個體對胚胎發(fā)育的影響,我們所選取的假孕均為同一周齡,即均為8周雌鼠。我們分別向假孕雌鼠體內(nèi)移植衰老雌鼠胚胎51枚,年輕雌鼠胚胎16枚。在雌鼠孕期19.5dpc的時候,檢測胎兒出生。我們發(fā)現(xiàn)移植了衰老雌鼠胚胎的假孕雌鼠有兩個胎兒出生,而移植了年輕雌鼠胚胎的假孕有10只胎兒出生,衰老雌鼠胚胎嚴(yán)重降低了胎兒的出生率及妊娠率。

    3.2 高組蛋白乙?;绞撬ダ洗剖笈咛ド钞惓5囊粋€主要原因

    3.2.1衰老雌鼠胚胎的乙?;缴?/p>

    影響衰老雌鼠胚胎發(fā)育能力低下的因素有很多。我們將研究的重點(diǎn)關(guān)注在基因組的表觀修飾上來。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化和組蛋白乙?;?。通過賴氨酸乙?;拿庖邿晒馊旧?,我們發(fā)現(xiàn)衰老雌鼠的乙?;旧臒晒鈴?qiáng)度極高(圖3-2)。初步證明了衰老雌鼠的乙酰化程度增高。

    3.2.2增加年輕雌鼠乙酰化程度獲得與衰老雌鼠一樣生理表型

    我們嘗試在體外培養(yǎng)環(huán)境下,增加年輕雌鼠胚胎的乙酰化程度進(jìn)行體外模擬實(shí)驗(yàn)。TSA是一種去乙酰化酶抑制劑,通過向胚胎培養(yǎng)液中添加該試劑,可以顯著提升胚胎的乙?;潭?。隨后,我們通過向同為8周雌鼠的胚胎培養(yǎng)液中添加TSA來增加年輕雌鼠胚胎的乙酰化程度。

    通過對到期雌鼠出生個數(shù)的比較,我們發(fā)現(xiàn)TSA處理后的年輕胚胎的雌鼠到期效率和年老雌鼠一致(圖3-3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,乙酰化程度升高后年輕雌鼠胚胎獲得了和年老雌鼠胚胎一致的生理表型。

    3.2.3 TSA處理的年輕雌鼠胚胎具有和年老雌鼠類似的乙?;潭?/p>

    為了確定是否TSA處理后年輕雌鼠胚胎的乙酰化程度和年老雌鼠類似,我們通過免疫熒光的手段對胚胎進(jìn)行染色。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過TSA處理后的雌鼠胚胎,具有了和年老雌鼠相類似的乙?;潭?。結(jié)果說明,乙?;潭雀淖兪撬ダ洗剖笈咛ベ|(zhì)量變差的一個重要原因。

    3.3 乙?;潭雀淖儗?dǎo)致了一些關(guān)鍵性基因表達(dá)量改變

    為了探究乙酰化程度改變?yōu)槭裁磿斐蓜游锪鳟a(chǎn)等現(xiàn)象,我們利用qpcr技術(shù)對年輕、年老、TSA處理的胚胎受精卵進(jìn)行了基因表達(dá)量的鑒定,通過鑒定,我們發(fā)現(xiàn)包括Peg10在內(nèi)的多個對胚胎發(fā)育到期的重要基因的表達(dá)量相對于野生型較高,并存在顯著差異(圖3-4)。因此,乙?;潭雀淖兒苡锌赡苁窃鰪?qiáng)了多個關(guān)鍵性基因的表達(dá),從而導(dǎo)致基因表達(dá)紊亂,造成了胎兒發(fā)育雌鼠問題與障礙。

    4 結(jié)論

    1.衰老雌鼠胚胎的乙酰化水平增高;

    2.通過體外模擬發(fā)現(xiàn)乙?;缴呤窃斐伤ダ洗剖笈咛グl(fā)育能力下降的一個主要原因;

    3.乙?;潭仍龈?,改變基因表達(dá)水平使得基因表達(dá)紊亂。

    5 創(chuàng)新點(diǎn)

    1.明確了乙酰化程度升高是雌鼠胚胎質(zhì)量變差的一個主要原因;

    2.證明了雌鼠流產(chǎn)問題很可能是乙酰化程度改變后造成基因表達(dá)量改變;

    3.為人類胚胎質(zhì)控提供一個新的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

    責(zé)編/萬海濱

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