高效液相色譜法測(cè)定硼替佐米中異戊醛含量

張德廣，李 貞，劉 霞，王啟帥

（1. 揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)上海海尼藥業(yè)有限公司，上海 浦東 201318；2. 揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)，江蘇 泰州 225321）

多發(fā)性骨髓瘤主要是因?yàn)楣撬铦{細(xì)胞異?？寺≡鲋乘碌囊环N惡性漿細(xì)胞病，在造血系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率占比約為 13%，且具有臨床治療效果差，治療后復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)[1]。已有多項(xiàng)研究表明：在臨床治療多發(fā)性骨髓瘤中，應(yīng)用硼替佐米藥物可以取得良好治療效果[2-3]。原料藥的質(zhì)量與制劑的質(zhì)量息息相關(guān)，硼替佐米原料藥在存儲(chǔ)過(guò)程中會(huì)降解產(chǎn)生異戊醛（圖 1），而異戊醛作為一種潛在基因毒性雜質(zhì)，會(huì)對(duì)原料藥的質(zhì)量產(chǎn)生影響[4-5]。因此，建立硼替佐米中異戊醛的分析方法對(duì)于原料藥的質(zhì)量控制十分必要。根據(jù) ICH M7《評(píng)估和控制藥物中 DNA 反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)以限制潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)》等相關(guān)指導(dǎo)原則及注射用硼替佐米的用法用量，得出硼替佐米原料藥中異戊醛的限度為質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.03%。

異戊醛無(wú)明顯紫外吸收，無(wú)法用紫外檢測(cè)器直接測(cè)定，同時(shí)由于硼替佐米對(duì)熱不穩(wěn)定，會(huì)降解產(chǎn)生異戊醛，不宜采用頂空-氣相法測(cè)定。2, 4-二硝基苯肼作為一種常用的檢測(cè)羰基化合物（-CO）的試劑，在酸性介質(zhì)中，羰基化合物與 2, 4-二硝基苯肼反應(yīng)，生成具有紫外吸收的 2, 4-二硝基苯腙，從而可以采用液相色譜檢測(cè)，間接測(cè)定樣品中的醛類(lèi)。本研究利用上述原理，檢測(cè)硼替佐米中的異戊醛。

Fig. 1 Degradation pathways of bortezomib圖 1 硼替佐米降解途徑

1 儀器與材料

1260 高效液相色譜儀（配四元梯度泵，DAD 檢測(cè)器和 Empower?3 色譜工作站，美國(guó)，安捷倫公司），XP205 電子分析天平（瑞士，梅特勒-托利多集團(tuán)）。

異戊醛對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 99.78%，批號(hào) 20151227，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），硼替佐米原料藥（批號(hào) 15012801，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇海慈生物醫(yī)藥有限公司），乙腈（色譜級(jí)，默克兩合股份有限公司），甲酸（分析級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），磷酸（分析級(jí)，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司），2, 4-二硝基苯肼鹽酸鹽（DNPH·HCl 分析級(jí)，東京化成工業(yè)株式會(huì)社），水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 衍生條件

醛類(lèi)常見(jiàn)的檢測(cè)方法有氣相色譜法、高效液相色譜法等[6]。由于硼替佐米對(duì)熱不穩(wěn)定，不宜采用氣相色譜法檢測(cè)。馬慶國(guó)等[7]以 2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑，采用高效液相色譜法檢測(cè)甲醛，并探討了衍生溫度和緩沖液等對(duì)衍生化反應(yīng)的影響；俞凌云等[8]以 2, 4-二硝基苯肼作為衍生化試劑，采用超高效液相色譜法檢廢水中乙二醛、甲醛等 7 種醛，具有良好回收率和靈敏度，同時(shí)專(zhuān)屬性也比較好。本研究選擇 2, 4-二硝基苯肼為衍生試劑，磷酸為酸催化劑，乙腈-水（20︰80，體積比）為溶劑，在室溫條件下，衍生化 30 min 即得。（試驗(yàn)顯示，衍生物峰面積 24 h 內(nèi)無(wú)明顯變化）。

2.2 色譜條件

色譜柱為 Waters symmetry C18（250 mm × 4.6 mm，5μm）；以乙腈（體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸）為流動(dòng)相 A，以水（體積分?jǐn)?shù) 0.1% 甲酸）為流動(dòng)相 B，按表1進(jìn)行線性梯度洗脫；流速為 1.0 mL?min-1；柱溫為 30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為 364 nm；進(jìn)樣量為 5μL[9-10]。

Table 1 Linear gradient elution table表 1 線性梯度洗脫表

2.3 溶液的制備

2.3.1 2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑溶液的制備

稱(chēng)取 2, 4-二硝基苯肼鹽酸鹽約 40 mg，置于 50 mL 量瓶中，加乙腈約 30 mL，再加磷酸 1 mL，超聲使之溶解，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 異戊醛標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

取異戊醛標(biāo)準(zhǔn)品約 30 mg，精密稱(chēng)定，置于 20 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取 1 mL，置 50 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 異戊醛-DNPH 對(duì)照品溶液的制備

精密量取異戊醛標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1 mL，置于 20 mL 量瓶中，加乙腈 3 mL，再精密加入 2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑溶液 1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。室溫放置 30 min，作為異戊醛-DNPH對(duì)照品溶液。

2.3.4 供試品溶液制備

取硼替佐米約 100 mg，精密稱(chēng)定，置于 20 mL 量瓶中，加乙腈 4 mL，水 1 mL，超聲使溶解，精密加入 2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑溶液 1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。室溫放置 30 min，作為供試品溶液。

2.3.5 空白溶液的制備

精密量取 2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑溶液 1 mL，置于 20 mL 量瓶中，加乙腈 4 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取本品約 100 mg，精密稱(chēng)定，置于 20 mL 量瓶中，精密加乙腈 3 mL，異戊醛標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1 mL，2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑溶液 1 mL 和水 1 mL，超聲使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，作為分離度溶液。取空白溶液，異戊醛-2, 4-二硝基苯肼對(duì)照品溶液，供試品溶液和分離度溶液，按“2.2”項(xiàng)方法檢測(cè)，記錄色譜圖，見(jiàn)圖 2。結(jié)果顯示：空白溶液色譜圖中在異戊醛-2, 4-二硝基苯肼峰位置無(wú)明顯干擾峰，供試品溶液和分離度溶液色譜圖中，異戊醛-2, 4-二硝基苯肼峰與相鄰峰之間的分離度均大于 1.5，滿足分離度要求，方法的專(zhuān)屬性良好。

2.4.2 檢測(cè)限和定量限考察

精密量取異戊醛-2, 4-二硝基苯肼對(duì)照品溶液 1 mL，置于 100 mL 量瓶中，加乙腈 25 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，作為定量限溶液。精密量取定量限溶液 2 mL，置 10 mL 量瓶中，加乙腈3 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，作為檢測(cè)限溶液。分別量取定量限溶液和檢測(cè)限溶液各 5μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明：異戊醛檢測(cè)限為 0.016 ng，定量限為 0.080 ng，說(shuō)明方法的靈敏度良好。

2.4.3 線性關(guān)系考察

按表2量取規(guī)定體積的異戊醛標(biāo)準(zhǔn)品溶液和 2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑溶液，置于 20 mL量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。分別進(jìn)樣 5μL 測(cè)定，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度ρ（mg?L-1）為橫坐標(biāo)，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為A= 1.397 × 105ρ– 1.203 × 103，r=1.000 0。研究結(jié)果表明，異戊醛在質(zhì)量濃度 0.015～2.998 mg?L-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

Fig. 2 HPLC chromatograms of blank (A), reference substances (B), resolution solutions (C) and samples (D)圖 2 空白溶液（A），對(duì)照品溶液（B），分離度溶液（C）和供試品溶液（D）的HPLC色譜圖

Table 2 Preparation of linear solutions表 2 線性溶液配制

2.4.4 精密度試驗(yàn)

取同一批次的硼替佐米，按“2.3.4”項(xiàng)下方法平行配制 6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣 5μL，記錄供試品溶液中異戊醛-2, 4-二硝基苯肼的峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算6 份供試品溶液中的異戊醛的含量。結(jié)果表明：6 份平行配制的供試品中異戊醛的含量的最大值為質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.000 7%，最小值為質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.000 6%，最大值與最小值之間的差值為 0.000 1%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批次的硼替佐米，精密稱(chēng)定 9 份，分成 3 組，每組 3 份，各組分別加入異戊醛標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量（相當(dāng)于限度濃度 0.03% 的 50%、100%、150%）和 2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑溶液1 mL，加乙腈 3 mL，用水稀釋至刻度。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算異戊醛的回收率和 RSD，結(jié)果見(jiàn)表3，表明方法的回收率良好。

Table 3 Results of recovery test (n = 9)表 3 加標(biāo)回收率結(jié)果（n = 9）

2.4.6 耐用性試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各 5μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)流動(dòng)相流速（0.8 mL?min-1和1.2 mL?min-1）、柱溫（25 ℃和35 ℃）、甲酸體積分?jǐn)?shù)（0.09%和0.11%）和更換不同批號(hào)的色譜柱，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，各變化條件下系統(tǒng)適用性符合要求，與正常條件相比，供試品的異戊醛含量無(wú)明顯差異，本方法耐用性良好。

3 結(jié)論與討論

a. 由于異戊醛無(wú)明顯紫外吸收，無(wú)法用液相直接測(cè)定，同時(shí)硼替佐米受高溫不穩(wěn)定，易降解產(chǎn)生異戊醛，因此亦不能采用氣相色譜測(cè)定。本方法利用異戊醛與 2, 4-二硝基苯肼反應(yīng)，生成穩(wěn)定的腙類(lèi)衍生物，建立了柱前衍生、高效液相色譜法測(cè)定硼替佐米中異戊醛含量的方法。

b. 該方法的靈敏度高，檢測(cè)限可達(dá)到 0.016 ng，線性范圍較寬，重復(fù)性好，異戊醛的回收率為 101.1%，耐用性好，可用于硼替佐米中異戊醛含量的測(cè)定。