格列吡嗪控釋片在健康人體的生物等效性預(yù)研究

陳 清 ，李軼群，王東凱

（1. 沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2. 北京紅林制藥有限公司，北京101407）

格列吡嗪是第二代磺脲類口服降血糖藥物[1]，其作用機(jī)制是對胰島β細(xì)胞的胰島素分泌進(jìn)行刺激，從而促進(jìn)胰島素的分泌。同時(shí)還可以增加脂肪細(xì)胞與胰島素的結(jié)合，放大胰島素的外周作用，減少肝糖的輸出，目前臨床廣泛應(yīng)用于 2 型糖尿病。本研究按照我國仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價(jià)的相關(guān)政策和要求，開展格列吡嗪控釋片受試制劑與參比制劑的生物等效性預(yù)試驗(yàn)，由于北京紅林制藥有限公司首次注冊時(shí)所采取的生物等效性試驗(yàn)為空腹給藥，故本次預(yù)試驗(yàn)采取餐后給藥的形式，為生物等效性正式試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支持和參考依據(jù)。同時(shí)，觀察受試制劑與參比制劑在健康受試者中給藥后的安全性。早期用高效液相色譜法測定血漿中格列吡嗪的濃度內(nèi)源性干擾較多、靈敏度較低[2]，尹然等建立的血漿中格列吡嗪的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[3]采用大氣輔助化學(xué)電離源（atmosphericpressure chemical ionization，APCI），選擇性檢測陽離子，具有較高的靈敏度和專屬性。孫雪等建立的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）采用電噴霧離子化源（electrospray ionization，ESI）電離方式[4]，具有靈敏度高、精密度好、專屬性強(qiáng)、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)，適用于格列吡嗪的藥代動(dòng)力學(xué)及生物等效性的研究。故本文采用 LC-MS/MS 法測定血漿中格列吡嗪的血藥濃度。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

QTRAP 5500 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國ABSCIEX公司），1260 Infinity 高效液相色譜儀（美國 Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

受試制劑（T）：格列吡嗪控釋片（北京紅林制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字 H20084634，規(guī)格為5 mg/片，批號(hào) 21701020），參比制劑（R）：格列吡嗪控釋片（Pfizer Pharmaceuticals LLC，輝瑞制藥有限公司進(jìn)口分裝，進(jìn)口藥品注冊證號(hào) H20100239、H20100240，國藥準(zhǔn)字 J20100129，規(guī)格為5 mg/片，批號(hào) S24038），格列吡嗪對照品：TLC Pharmaceutical Standards（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.1%，批號(hào) 1169-074A1），內(nèi)標(biāo) Glipizide-d11，Toronto Research Chemicals INC（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%，同位素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 97.6%，批號(hào) 7-SDJ-115-1）。

2 方法

2.1 受試者篩選

在第 1 次給藥 -14～-1 天對中國健康志愿者進(jìn)行篩選，本研究經(jīng)倫理委員會(huì)及中國人類遺傳資源管理辦公室批準(zhǔn)，健康志愿者對本研究知情，并簽署知情同意書。經(jīng)篩選，共 12 名健康受試者正式入組（男女隨機(jī)，其中男性 7 例，女性 5 例）。所有受試者于試驗(yàn)前接受全面體檢，結(jié)果正常。受試者均無既往病史和藥物過敏史，精神狀態(tài)良好，無吸煙、酗酒嗜好，試驗(yàn)前兩周未服用任何藥物。

2.2 分組及給藥

采用開放、隨機(jī)、兩周期交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將 12 例中國健康受試者隨機(jī)分為 2 組，每組 6 例。受試者于給藥前一天禁食過夜 10 h 以上后，于第 1 天餐后口服受試制劑或參比制劑 1 片，用240 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 20% 葡萄糖水送服。于給藥前 60 min 內(nèi)（0 h）和給藥后 1、2、3、4、6、8、9、10、12、16、24、36、48、72 h 由靜脈取血 4 mL，血樣置含乙二胺四乙酸二鉀抗凝劑離心試管中，輕柔顛倒混勻，離心（（4 ± 2）℃，4 000 rpm，10 min），分離后的血漿于（–80 ± 10）℃冷凍保存，待測。清洗期 7 天后交叉給藥。

2.3 血漿樣品分析方法的建立

2.3.1 血漿樣品處理方法

精密量取 100μL 血漿樣品至 2 mL 離心管中，加入 400μL 乙腈，渦旋混合 5 min，于 4 700 rpm、4 ℃ 離心 10 min，取上清液 100μL，向其中加入 100μL 體積分?jǐn)?shù)為 10% 的乙腈稀釋，渦旋混合 5 min，準(zhǔn)備進(jìn)樣分析。

2.3.2 色譜條件與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為 Kinetex C18（50 mm ×2.1 mm，2.6μm）；流動(dòng)相 A：體積分?jǐn)?shù)為 0.1%甲酸，流動(dòng)相 B：乙腈；洗脫方式：梯度洗脫（0.6 min、體積分?jǐn)?shù)為65%的B；1.2 min、體積分?jǐn)?shù)為 95% 的 B；2.0 min、體積分?jǐn)?shù)為 50% 的 B）；流速：0.6 mL?min-1。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化源（electrospray ionization，ESI），正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM），離子化電壓：5 500 V，離子源溫度：550 ℃，碰撞能量（collision energy，CE）19 V。

2.4 分析方法的確證

2.4.1 專屬性

在 2.3.2 條件下格列吡嗪和內(nèi)標(biāo)（internal standard，IS）的出峰時(shí)間分別在 0.16 min 和 0.37 min左右，空白血漿在兩者的峰位處均無雜質(zhì)干擾，專屬性良好（見圖1）。

Fig. 1 Typical chromatograms of glipizide and internal standard圖 1 血漿中格列吡嗪色譜圖

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

配制血藥質(zhì)量濃度為 2.00、4.00、20.0、50.0、100、150、250、300μg?L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，進(jìn)樣檢測，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y= 1.046×10-2X- 4.000×10-5（r= 0.999 6）。結(jié)果表明，格列吡嗪血藥濃度在 2.00～300μg?L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為 2.00μg?L-1。

2.4.3 精密度和準(zhǔn)確度

處理定量下限、低、中、高 4 個(gè)質(zhì)量濃度（2.00、6.00、40.0、200μg?L-1）的血漿樣品各 6 份，進(jìn)樣 3 天，批內(nèi)精密度 RSD 為 0.7%～4.8%，批內(nèi)準(zhǔn)確度均值（與標(biāo)示濃度的偏差）范圍-5.0%～4.7%；批間精密度 RSD 為 2.0%～4.9%，批間準(zhǔn)確度均值（與標(biāo)示濃度的偏差）范圍-1.3%～1.5%。符合生物樣本分析檢測要求。

2.4.4 提取回收率

配制質(zhì)量濃度分別為 6.00、40.0、200μg?L-1的血漿樣品各 6 份，三個(gè)質(zhì)量濃度的格列吡嗪提取回收率分別為（98.8 ± 3.4）%、（111.7 ± 8.2）%和（111.7 ± 3.7）%，平均提取回收率為（107.4± 5.1）%。符合生物樣本分析檢測要求。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 WinNonlin 7.0 軟件用非房室數(shù)學(xué)模型分析方法，進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的估算和分析。對AUC 和ρmax作對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，用雙單側(cè)t檢驗(yàn)和計(jì)算 90% 置信區(qū)間的統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行等效性檢驗(yàn)。若ρmax、AUC0-t和 AUC0-∞的幾何均值比的 90% 置信區(qū)間在 80.00%～125.00% 等效區(qū)間內(nèi)，即可判定兩制劑人體生物等效。

3 結(jié)果

3.1 受試者入組及完成情況

實(shí)際入組 12 例受試者，均完成試驗(yàn)。納入藥動(dòng)學(xué)評價(jià) 12 例。

3.2 藥-時(shí)曲線

受試者餐后服用格列吡嗪受試制劑和參比制劑平均血藥濃度-時(shí)間曲線，見圖2。

Fig. 2 Mean plasma concentration-time curves of glipizide after taking the test and reference drugs in fed state圖 2 受試者餐后口服格列吡嗪受試制劑和參比制劑后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

3.3 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

12名受試者分別單次口服參比制劑與受試制劑后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1、表2。

Table 1 The main pharmacokmetic parameters of glipizide after taking the reference drugs in 12 healthy volunteers表 1 12名受試者口服參比制劑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

Table 2 The main pharmacokmetic parameters of glipizide after taking the test drugs in 12 healthy volunteers表 2 12名受試者口服受試制劑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3.4 生物等效性檢驗(yàn)

ρmax、AUC0-t及 AUC0-∞在進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行雙向單側(cè)t檢驗(yàn)。計(jì)算受試制劑與參比制劑ρmax、AUC0-t和 AUC0-∞的幾何均值比的 90% 置信區(qū)間。表3為生物等效性評價(jià)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

Table 3 The evaluation of bioequivalence in 12 healthy volunteers表 3 12名受試者生物等效性評價(jià)的結(jié)果

受試制劑與參比制劑的ρmax的幾何均值比的 90% 置信區(qū)間為（71.76%～103.73%），AUC0-t的幾何均值比的 90% 置信區(qū)間為（62.07%～112.37%），AUC0-∞的幾何均值比的 90% 置信區(qū)間為（61.91%～110.57%），均超出 80.00%～125.00%，格列吡嗪控釋片的受試制劑和參比制劑不符合生物等效性標(biāo)準(zhǔn)。

3.5 方差分析

采用 WinNonlin 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，格列吡嗪的ρmax、AUC0-t及 AUC0-∞再進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換后，采用交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析，分析給藥序列間（sequence）、制劑間（formulation）、個(gè)體間（sequence × subject）和周期間（period）的差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05，表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。方差分析結(jié)果見表4～表6。結(jié)果表明：對于ρmax、AUC0-t、AUC0-∞，給藥序列間、個(gè)體間、制劑間和周期間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。

Table 4 Variance analysis of ln ρmax表 4 ln ρmax的方差分析結(jié)果

Table 5 Variance analysis of ln AUC0-t表5 ln AUC0-t的方差分析結(jié)果

Table 6 Variance analysis of ln AUC0-∞表 6 ln AUC0-∞的方差分析結(jié)果

3.6 安全性評價(jià)

試驗(yàn)中，12 例健康受試者全部完成試驗(yàn)，6 例受試者共發(fā)生 7 例次不良反應(yīng)。其中受試制劑有 4 例（33%）受試者 4 例次，參比制劑有 3 例（25%）受試者 3 例次。停藥后或?qū)ΠY治療后，均已隨訪至恢復(fù)，整個(gè)試驗(yàn)過程中無嚴(yán)重不良事件發(fā)生。

4 討論

從受試者餐后服用格列吡嗪受試制劑和參比制劑的藥-時(shí)曲線來看，參比制劑血藥濃度較受試制劑高，可能是由于參比制劑所用的聚氧乙烯與受試制劑所用的聚維酮在調(diào)節(jié)藥物釋放速率上存在一定差異[5]。聚氧乙烯是一種結(jié)晶性、熱塑性的水溶性聚合物，由于其存在 C-O-C 鍵，通常具有柔順性，其吸水速度和水合速度均較慢，因此藥物釋放的時(shí)滯較長。聚維酮是非離子型水溶性高分子化合物，極易溶于水，以聚維酮為載體的控釋片通常具有較短的時(shí)滯，因此受試制劑的tmax比參比制劑快了約 3 個(gè)小時(shí)。但聚維酮吸水膨脹后可能形成比較致密的凝膠層，又進(jìn)一步阻滯了藥物的溶出。提示下一步一致性評價(jià)研究，應(yīng)從調(diào)節(jié)藥物釋放的輔料特性著手，優(yōu)化其處方，適當(dāng)調(diào)整處方比例，并充分考察各因素影響。另本次試驗(yàn)為預(yù)試驗(yàn)，由于預(yù)試驗(yàn)樣本量較小，個(gè)體內(nèi)變異系數(shù)較高，個(gè)體的數(shù)據(jù)對最終結(jié)果影響較大。提示在正式生物等效性試驗(yàn)時(shí)，可以根據(jù)本次預(yù)試驗(yàn)ρmax的個(gè)體內(nèi)變異系數(shù)估算擴(kuò)大樣本量，以期達(dá)到和原研藥生物等效的目的。