長鏈非編碼RNA MEF2C-AS1調(diào)控成骨細胞功能的機制研究

何洋洋，王力剛，趙玉馳

（1.南華大學(xué)附屬邵陽醫(yī)院 骨科，湖南 邵陽 422000；2.深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院骨科，廣東 深圳 518000）

骨質(zhì)疏松癥被定義為全身性、進行性骨骼疾病，其特點是骨形成與骨吸收之間的不平衡引起骨強度下降從而導(dǎo)致骨折風(fēng)險增加。骨質(zhì)疏松的治療以藥物治療為主，根據(jù)具體治療機制的不同，可大致分為基礎(chǔ)補充劑、減少骨吸收劑及促進骨合成劑。近年來，人們一直探索著治療骨質(zhì)疏松的新途徑，其中就包括對SOST基因的研究。SOST基因位于人類基因組的17q12-21 染色體中，其編碼的骨硬化蛋白通過影響Wnt/β-catenin 信號途徑對成骨細胞的骨形成起抑制作用[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，肌細胞增強因子2C（myocyte enhancer factors 2C, MEF2C）是SOST基因的遠端增強子ECR5 依賴性SOST 表達的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[2]。并且發(fā)現(xiàn)MEF2C敲除小鼠表達SOST，且進行性降低了40%～70%，相比對照組小鼠骨密度增加[3]。這說明MEF2C基因是骨細胞表達骨硬化蛋白所必需的。反義長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）作為內(nèi)源性RNA，與其他轉(zhuǎn)錄物序列互補，可在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達[4]。反義基因MEF2C-AS1與正義基因MEF2C的5'UTR 區(qū)域重疊，這意味著lncRNA MEF2C-AS1 可能在MEF2C 表達和/或翻譯中起作用[5]。因此本研究擬通過成骨細胞實驗，觀察MEF2C-AS1 對MEF2C、SOST 的作用，揭露其對骨量的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系及培養(yǎng)

人成骨細胞系hFOB1.19 購自美國ATCC 菌種保藏管理中心，采用DMEM/F12 培養(yǎng)基+10%FBS+0.3 mg/ml G418+1%青霉素-鏈霉素混合溶液，于34℃、5%二氧化碳及90%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用人成骨細胞系分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1a（對照組）、pcDNA3.1a-MEF2C-AS1（過表達MEF2C-AS1組）、Smart Silencer 陰性對照（陰性對照組）、lncRNA MEF2C-AS1 Smart Silencer（沉 默MEF2C-AS1 組）、pcDNA3.1a-MEF2C（過表達MEF2C 組）、pcDNA3.1a-MEF2C-AS1+pcDNA3.1a-MEF2C（ 過 表 達MEF2CAS1+MEF2C 組）。

1.2 主要儀器和試劑

Tanon 2500 全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)、Tanon 5200Multi 全自動化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司，Eppendorf Centrifuge 5418R 高速臺式離心機購自德國Eppendorf 公司，7900HT Fast real-time PCR 系統(tǒng)購自美國ABI 公司，T100TMThermal Cycler PCR 儀、高流電泳儀電源、Mini-PROTEAN?Tetra 電泳槽、大型水平電泳槽購自美國Bio-Rad 公司，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）（型號MK300）購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，MEF2C、SOST（qRT-PCR 引物）、si-MEF2CAS1 購自蘇州瑞博生物技術(shù)有限公司，MEF2C、SOST（人、兔抗）購自武漢愛博泰克生物技術(shù)有限公司，超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、QuickblockTM封閉液、Western 轉(zhuǎn)膜液、SDSPAGE 電泳液、Western 洗滌液（10X）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Phusion High-Fidelity DNA Polymerase、PowerUp SYBR Green Master Mix購自美國ThermoFisher Scientific 公司）。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

1.3.1 構(gòu)建MEF2C-AS1 的過表達載體pcDNA3.1a-MEF2C-AS1克隆MEF2C-AS1基因的mRNA 序列，設(shè)計引物： 5'-GGGGTACCAATTATTGCCGATCCTCC CC-3'（KpnⅠ）和5'-CGGGATCCTTTTTTTTTTTTTT TTTCAGAAAG-3'（BamHⅠ），由蘇州瑞博生物技術(shù)有限公司合成。MEF2C-AS1基因的mRNA 片段DNA通過PCR 從cDNA 基因文庫中獲得，將擴增的PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上電泳分離后，獲取目的片段，用膠回收試劑盒回收目的片段。然后利用BamHⅠ和KpnⅠ內(nèi)切酶切下PCR 產(chǎn)物目的片段及切開pcDNA3.1a 載體，將目的片段用T4 連接酶連接到pcDNA3.1a 載體中進行雙酶切驗證。

1.3.2 構(gòu)建MEF2C 基因的過表達載體克隆MEF2C基因的編碼序，設(shè)計過表達引物5'-CGGGATCCATG GGGAGAAAAAAGATTCAG-3' 和5'-GGGGGGCCCT CATGTTGCCCATCCTTCAG-3'，通過PCR 擴增得到MEF2C的編碼序列。目的基因片段從人源的cDNA中獲得，PCR 擴增后回收DNA，通過限制性內(nèi)切酶修飾目的片段和載體，連接轉(zhuǎn)化。然后再進行雙酶切驗證。

1.3.3 沉默lncRNA由瑞博生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成LncRNA MEF2C-AS1 的Smart Silencer（編號： lnc3190628021353），Smart Silencer 可以在核內(nèi)和細胞質(zhì)中全方位抑制LncRNA，且抑制效率高。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染

在6 孔板中培養(yǎng)hFOB1.19（人SV40 轉(zhuǎn)染成骨細胞）至80%匯集，將質(zhì)粒DNA/siRNA 按實驗方案用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)入hFOB1.19 細胞中。

1.5 總RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄

取部分轉(zhuǎn)染后的hFOB1.19 細胞，于轉(zhuǎn)染48 h 后用PBS 清洗2 遍，每孔加入1 ml Trizol 試劑，按照Trizol 試劑說明書提取hFOB1.19 細胞總RNA。并按照基因組DNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置于-20℃保存。

1.6 堿性磷酸酶成骨活性測定

收集轉(zhuǎn)染3 d 的成骨細胞，采用Triton X-100 的緩沖液裂解細胞。使用ALP檢測試劑盒測量ALP活性。采用ALP 染色試劑盒進行ALP 染色。

1.7 qRT-PCR

qRT-PCR檢測MEF2C正向引物： 5'-GTATAGATG CTTGGACAGACCC-3'，反向引物： 5'-GCAGGTTTGTG AGCATTCTTG-3'，產(chǎn)物長度97 bp。qRT-PCR 檢測SOST正向引物： 5'-TTCCGAAGAGAAGTGAAAGG TTC-3'，反向引物： 5'-GTGCTGGTCTGTGAGTTTGT GAT-3'，產(chǎn)物長度81 bp。qRT-PCR 檢測18S rRNA正向引物： 5'-CGGCGACGACCCATTCGAAC-3'，反向引物： 5'-GAATCGAACCCTGATTCCCCGTC-3'，產(chǎn)物長度108 bp，所檢測基因及合成內(nèi)參18 S 的引物由蘇州瑞博生物技術(shù)公司合成。根據(jù)ABI7500 qRT-PCR儀說明書進行操作，以18 S rRNA 為內(nèi)參照。PCR 反應(yīng)體系： 2×SYBR Green 5μl，正向和反向引物各0.5μl，ROXI 0.2μl，cDNA 1μl，ddH2O 2.8μl，總體系為10μl。PCR 反應(yīng)條件： 95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，95℃、15 s繪制熔解曲線，共40 個循環(huán)。每個實驗至少重復(fù)3 次，用2-ΔΔCt法分析。

1.8 Western blotting

取另一部分轉(zhuǎn)染后的hFOB1.19 細胞用預(yù)冷PBS清洗2 遍，加適量預(yù)冷的細胞RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解10 min，使用刮棒刮取培養(yǎng)孔中的細胞，收集裂解液，14 000 r/min離心10 min，上清即為蛋白提取液。利用考馬斯亮藍測定蛋白濃度。加入6×SDS 上樣緩沖液，95℃變性5 min。配制10% SDS-PAGE 凝膠，將變性后的蛋白上樣，恒壓100 V 電泳2 h。電泳結(jié)束后在200 mA 恒流條件下1 h 將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜上，再置于5%脫脂牛奶的TBS 封閉液在搖床上封閉1 h。將抗體按比例在牛血清白蛋白中稀釋，按千分之一加入疊氮化鈉，使抗體和膜充分接觸，4℃孵育過夜。次日，回收一抗，-20℃保存，一般抗體可重復(fù)使用，用TBST 洗膜3 次，15 min/次。根據(jù)一抗的來源選擇二抗，將二抗稀釋于TBS 中，常溫孵育1 h，之后用TBST 洗膜3 次，10 min/次，顯影。以GADPH 作為內(nèi)參照，對曝光條帶進行定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graphpad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析及繪圖。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MEF2C-AS1 的表達對MEF2C、SOST 基因的影響

兩組MEF2C、SOST mRNA 和蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），過表達MEF2CAS1 組較對照組低。說明在成骨細胞系中，lncRNA MEF2C-AS1可以抑制MEF2C 及SOST的表達。見表1和圖1。

2.2 過表達MEF2C-AS1 對ALP 活性的影響

過表達MEF2C-AS1 組與對照組ALP 活性相對表達量分別為（1.024±0.013）和（0.499±0.008），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=58.898，P=0.000），過表達MEF2C-AS1 組較對照組高，lncRNA MEF2C-AS1能提高成骨分化過程中早期標(biāo)志物ALP 的活性。見圖2、3。

表1 對照組與過表達MEF2C-AS1 組MEF2C、SOST mRNA 和蛋白相對表達量比較 （±s）

表1 對照組與過表達MEF2C-AS1 組MEF2C、SOST mRNA 和蛋白相對表達量比較 （±s）

組別 MEF2C mRNA SOST mRNA MEF2C 蛋白 SOST 蛋白對照組 0.946±0.059 1.051±0.049 0.526±0.053 0.118±0.015過表達MEF2C-AS1 組 0.038±0.002 0.048±0.005 0.127±0.015 0.034±0.007 t 值 26.822 35.066 12.485 8.594 P 值 0.000 0.000 0.000 0.001

圖1 過表達MEF2C-AS1 組與對照組MEF2C、SOST mRNA 和蛋白相對表達量比較 （±s）

圖2 MEF2C 提高ALP 活性

圖3 過表達MEF2C-AS1 組與對照組ALP 活性 （±s）

2.3 沉默MEF2C-AS1 對MEF2C、SOST 基因表達的影響

兩組MEF2C、SOST mRNA 和蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），沉默MEF2CAS1 組較陰性對照組高。結(jié)果說明抑制MEF2CAS1 能增加MEF2C、SOST 的表達，進一步驗證了MEF2C-AS1 對MEF2C、SOST 的抑制作用。見表2和圖4。

表2 沉默MEF2C-AS1 組與對照組MEF2C、SOST mRNA 和蛋白相對表達量比較 （±s）

表2 沉默MEF2C-AS1 組與對照組MEF2C、SOST mRNA 和蛋白相對表達量比較 （±s）

組別 MEF2C mRNA SOST mRNA MEF2C 蛋白 SOST 蛋白陰性對照組 0.986±0.028 0.916±0.099 0.163±0.031 0.100±0.016沉默MEF2C-AS1 組 5.039±0.576 4.087±0.263 1.180±0.152 0.571±0.071 t 值 12.177 19.532 11.329 11.230 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖4 沉默MEF2C-AS1 組與陰性對照組MEF2C、SOST mRNA 和蛋白相對表達量比較 （±s）

2.4 過表達MEF2C-AS1+MEF2C 基因?qū)OST表達的影響

經(jīng)NCBI Blast 比對，筆者發(fā)現(xiàn)MEF2C-AS1 與MEF2C 存在反向互補配對堿基序列，反向互補片段長 度151 bp，位 于MEF2C-AS1（transcript variant 3 NR_109941.1）序列和MEF2C（XM_024446057.1）序列的5'UTR 起始（見圖5）。這提示MEF2C-AS1 在某種程度上可能對MEF2C 起調(diào)控作用。各組MEF2C、SOSTmRNA 和蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較顯示，過表達MEF2C組與對照組的SOST mRNA 和蛋白比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），過表達MEF2C 組較對照組高，說明MEF2C 能調(diào)控SOST 的表達；過表達MEF2C-AS1組與對照組的SOST mRNA 和蛋白比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），過表達MEF2C-AS1 組較對照組低；過表達MEF2C-AS1+MEF2C 組與過表達MEF2C-AS1組的SOST mRNA 和蛋白比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），過表達MEF2C-AS1+MEF2C 組較過表達MEF2C-AS1 組高。結(jié)果提示在過表達MEF2C-AS1的基礎(chǔ)上加過表達MEF2C，原本受抑制的SOST 表達有所恢復(fù)，說明在成骨細胞中MEF2C-AS1 是通過抑制MEF2C 而進一步抑制SOST 的表達。見表3和圖6、7。

圖5 MEF2C-AS1 與MEF2C 互補序列示意圖

表3 各組MEF2C、SOST mRNA 和蛋白相對表達量比較 （±s）

表3 各組MEF2C、SOST mRNA 和蛋白相對表達量比較 （±s）

注： ①與對照組比較，P ＜0.05；②與過表達MEF2C-AS1 組比較，P ＜0.05。

組別 MEF2C mRNA MEF2C 蛋白 SOST mRNA SOST 蛋白對照組 0.961±0.129 0.366±0.054 0.976±0.174 0.247±0.019過表達MEF2C-AS1 組 0.062±0.005① 0.027±0.015① 0.011±0.005① 0.027±0.003①過表達MEF2C 組 4.190±0.252① 1.130±0.197① 5.737±0.420① 0.762±0.021①過表達MEF2C-AS1+MEF2C 組 0.503±0.018② 0.356±0.149② 0.511±0.007② 0.210±0.043②F 值 525.520 40.821 406.266 447.214 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖6 各組MEF2C、SOST mRNA 和蛋白相對表達量比較 （±s）

圖7 各組SOST、MEF2C 蛋白的表達

3 討論

骨代謝需要復(fù)雜的調(diào)節(jié)控制和轉(zhuǎn)錄活性來支持基因表達，以響應(yīng)骨形成與再吸收譜系細胞中激素、生長因子和細胞因子介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)。在人類基因組中，只有極少數(shù)被轉(zhuǎn)錄為蛋白質(zhì)，絕大多數(shù)都是非編碼RNA，根據(jù)其核苷酸長度，可分為lncRNA、Piwi互作RNA、小干擾RNA 及microRNA 等。lncRNA 是指長度＞200 核苷酸的轉(zhuǎn)錄物家族，其不編碼蛋白質(zhì)。此類RNA 可調(diào)節(jié)基因表達的多個方面，包括轉(zhuǎn)錄、加工和轉(zhuǎn)錄后控制途徑。同樣，lncRNA 也被證實可以調(diào)節(jié)蛋白功能并組織多蛋白復(fù)合物組裝。有研究表明lncRNA 可能參加細胞通信[6]。lncRNA 作為非編碼RNA 的一種，主要作用機制包括： ①可以結(jié)合≥1種染色質(zhì)修飾復(fù)合物并將其活性靶向特定的DNA 基因座；②介導(dǎo)的染色質(zhì)修飾可以激活或抑制基因的表達[7]；③lncRNA 轉(zhuǎn)錄可導(dǎo)致染色質(zhì)重塑，影響調(diào)節(jié)因子的結(jié)合；④可以通過結(jié)合特異性轉(zhuǎn)運因子來調(diào)節(jié)基因表達，從而抑制特定轉(zhuǎn)錄因子的核定位[6]。

反義lncRNA 是lncRNA 的一種，參與多種生物學(xué)行為，如X 染色體失活、表觀遺傳調(diào)控，可以通過與其他RNA 的堿基對互補，形成RNA 互補雙鏈，調(diào)控特定靶基因的表達[4，8]。例如，反義基因RAB11BAS1與RAB11B 呈負相關(guān)，可通過RAB11B 影響骨肉瘤細胞的惡性生物學(xué)行為[9]。反義基因POSH2-AS1可正向調(diào)控靶基因POSH2，從而影響肺癌細胞[10]。筆者通過序列比對發(fā)現(xiàn)lncRNA MEF2C-AS1 與MEF2C存在反向互補，認為lncRNA MEF2C-AS1 能起到調(diào)控MEF2C 的作用。已有部分文獻發(fā)現(xiàn)lncRNA 與骨質(zhì)疏松的聯(lián)系[11-12]。本研究著重探究lncRNA MEF2C-AS1對成骨細胞的影響，為骨質(zhì)疏松的治療探索新的分子靶點。首先過表達MEF2C-AS1 發(fā)現(xiàn)MEF2C、SOST的表達下降，然后抑制MEF2C-AS1 發(fā)現(xiàn)MEF2C、SOST 的表達升高，這提示lncRNA MEF2C-AS1 對MEF2C、SOST 的表達起抑制作用，又由于實驗中的人成骨細胞系具有分化為成熟的成骨細胞功能，并可以表達正常成骨細胞的特性。提示該lncRNA 能通過抑制MEF2C、SOST 的表達，對機體骨量的增加起到積極作用。在此基礎(chǔ)上，為了進一步明確MEF2CAS1 是通過MEF2C 影響SOST 的表達，筆者設(shè)計了拯救實驗，同時過表達MEF2C-AS1 和MEF2C。實驗結(jié)果顯示，同時過表達MEF2C+MEF2C-AS1 組相比過表達MEF2C-AS1 組的SOST mRNA 和蛋白相對表達量升高。這一結(jié)果提示在過表達MEF2C-AS1 的基礎(chǔ)上過表達MEF2C，使原本受抑制的SOST 表達有所恢復(fù)，說明MEF2C-AS1 是通過抑制MEF2C，從而進一步抑制SOST 的表達。

ALP 廣泛分布于肝臟、骨及小腸中。特別在骨代謝研究領(lǐng)域被作為骨形成指標(biāo)之一。ALP 由未成熟的成骨細胞分泌，可作為骨形成的早期標(biāo)志物，其表達和分泌會隨著成骨分化的增加而增加。本研究發(fā)現(xiàn)MEF2C-AS1 能提高成骨分化過程中早期標(biāo)志物ALP的活性。ALP 活性增加是成骨細胞分化成熟的早期標(biāo)志。這說明MEF2C-AS1 能促進成骨細胞的分化成熟，因此對增加機體骨量有潛在作用。

骨重塑包括破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的骨形成，這是維系骨骼正常生長及退變的機制，這種緊密耦合過程的失衡將導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。成骨細胞和破骨細胞可以通過細胞間的直接接觸，以及細胞因子和細胞外基質(zhì)互相作用，彼此連通。而且成骨細胞負責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌及礦化，并產(chǎn)生護骨素、核因子κB 受體活化體配體等調(diào)節(jié)破骨細胞的功能[13]。所以成骨細胞對于骨形成代謝具有重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)SOST基因編碼的骨硬化蛋白對成骨細胞起負反饋作用，減少骨的形成，減少機體骨量[14]。此外，SOST基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）位點rs2023794 和rs74252774 的多態(tài)性與大量中國絕經(jīng)后女性腰椎平均骨密度有關(guān)[15]。2 期臨床研究也表明，絕經(jīng)后婦女注射骨硬化蛋白抗體可導(dǎo)致脊柱和髖部骨密度增加[16]。調(diào)控SOST 的表達似乎可以成為治療骨質(zhì)疏松的新手段。MEF2C基因可以與SOST 上游的遠端增強子ECR5 結(jié)合，從而調(diào)節(jié)SOST 的表達[2]。有研究發(fā)現(xiàn)MEF2C基因SNP 位點rs1366594 與骨質(zhì)疏松存在相關(guān)性[17]。本實驗證實lncRNA MEF2C-AS1 可通過抑制MEF2C，進而抑制SOST，促進成骨細胞的分化成熟，對機體骨量的增加可能產(chǎn)生積極作用。而且有研究通過識別骨質(zhì)疏松基因SNP 位點發(fā)現(xiàn)MEF2C-AS1 與骨質(zhì)疏松相關(guān)[18]。這都提示lncRNA MEF2C-AS1 可通過作用于MEF2C，成為未來治療骨質(zhì)疏松的一個新靶點。但本研究主要針對MEF2C-AS1 對下游基因的表達進行檢測，成骨細胞功能檢測還需完善，也未涉及MEF2C-AS1 調(diào)控MEF2C 的具體機制，其更為復(fù)雜的作用仍需進一步研究證實。