FOXO3a蛋白對腦缺血損傷大鼠細(xì)胞自噬的影響研究

周乃強(qiáng)，姚楊玲，黃堅毅

缺血性腦損傷屬于腦血液循環(huán)障礙性疾病[1]。一般臨床表現(xiàn)為運(yùn)動障礙如偏癱以及言語不清等，有些還會造成智力障礙[2]。FOXO3a蛋白可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定，B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)與Bax是相互對立的一對基因，與細(xì)胞凋亡之間有密切關(guān)聯(lián)，對神經(jīng)系統(tǒng)有重要作用。本研究通過檢測腦缺血性大鼠FOXO3a蛋白、Bcl-2蛋白及Bax蛋白表達(dá)水平，探究其在腦缺血性大鼠中的水平變化及對大鼠神經(jīng)功能和細(xì)胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 研究動物與分組 選取20只Wistar大鼠，由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供，雌雄不限，月齡3～6(3.8±1.5)個月，體質(zhì)量200～250(220±8)g。所有大鼠均養(yǎng)殖在清潔籠子里，室溫(25.5±3.8)℃，相對濕度40%～45%，每天光照12 h，喂飲純凈水。經(jīng)過1周飼養(yǎng)時間后，隨機(jī)分為正常組和腦缺血組，其中正常組10只，腦缺血組10只。本實(shí)驗(yàn)獲得我院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦缺血模型的建立 采取四動脈結(jié)扎法，參照杜郭佳等[3]的方法，并作出適當(dāng)改進(jìn)，腦缺血組大鼠均用10%的水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉，以俯臥體位固定在立體定向儀上，將頭頂部毛發(fā)剃除并消毒后，使用高頻電刀在第一頸椎橫突翼的左右橫突孔永久性阻斷椎動脈血流，1 d后，使用動脈夾將大鼠兩側(cè)的頸總動脈夾閉，5 min后打開動脈夾，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)后大鼠出現(xiàn)意識混亂、瞳孔散大、呼吸加快、無痛感以及瞳孔對光反射消失等，說明腦缺血大鼠模型建造成功，大鼠實(shí)驗(yàn)過程中死亡(2只)以及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后造模不成功者棄用。

1.2.2 標(biāo)本采集 將待測大鼠用乙醚麻醉后，斷頭處死，切取腦組織70 mg，加入10倍體積的離心緩沖液，手動勻槳10 min，用離心機(jī)以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速分離，取上層血漿電動勻漿后，用離心機(jī)以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速分離，取上層血漿放置-50 ℃冰柜中凍存。

1.2.3 免疫組化法檢測FOXO3a蛋白、Bax蛋白及Bcl-2蛋白 加入二甲苯和乙醇進(jìn)行脫蠟處理，加入枸櫞酸緩沖液進(jìn)行切片抗原熱修復(fù)，0.3% H2O2殺死過氧化物酶的活性，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液清洗3～5次，待切片干燥加入稀釋一定比例的一抗，在37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)1～2 h，之后再次使用PBS緩沖液清洗3～5次，使用DAB顯色試劑盒顯色3～5 min。通過比色達(dá)到檢測FOXO3a蛋白、Bax蛋白及Bcl-2蛋白的目的。

1.2.4 雙盲法測定神經(jīng)功能評分 采用雙盲法對大鼠手術(shù)后1 d、2 d、3 d進(jìn)行轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)。把大鼠放在30°的夾角里，觀察大鼠往哪個方向轉(zhuǎn)移，記錄其轉(zhuǎn)向，向左或是向右，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次，每次實(shí)驗(yàn)間隔大于15 s。評定神經(jīng)功能評分，神經(jīng)功能評分=右轉(zhuǎn)次數(shù)/總次數(shù)×100%。

1.2.5 Western Blot檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3細(xì)胞自噬功能的改變 將凍存標(biāo)本通過SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，將適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液加入，靜置15 min；在100 V的環(huán)境中電泳10 min，電泳結(jié)束后，將電轉(zhuǎn)膜放置封閉在37 ℃環(huán)境中的搖床上，然后加入10%的牛奶，持續(xù)1.5 h；加入一抗，加入TBST稀釋按(1∶1 000)稀釋一抗，在4 ℃的環(huán)境下，經(jīng)過孵育后過夜保存；第2天用TBST緩沖液清洗，在室溫中與二抗結(jié)合，孵育1 h。再次用TBST緩沖液清洗，最后將其浸泡在底物溶液中進(jìn)行顯色，采用BCA蛋白定量試劑盒，分析灰度值，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值=目的蛋白相對表達(dá)量，達(dá)到檢測細(xì)胞自噬的目的。

1.2.6 倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬 用5%水合氯醛溶液將大鼠麻醉，固定，注入4%多聚甲醛PBS緩沖液150 mL，斷頭取腦，將腦組織存于4%多聚甲醛固定液中，包埋、切片、脫蠟，進(jìn)行熒光染色。用倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬現(xiàn)象的產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量自噬熒光顆粒，這些現(xiàn)象提示可能有自噬發(fā)生。

2 結(jié) 果

2.1 正常組和腦缺血組大鼠FOXO3a蛋白表達(dá)比較 腦缺血組大鼠FOXO3a蛋白表達(dá)明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1、圖1。

表1 兩組大鼠FOXO3a蛋白表達(dá)比較(±s)

圖1 FOXO3a蛋白免疫組化圖(×100)

2.2 正常組和腦缺血組促細(xì)胞凋亡Bax蛋白及Bcl-2蛋白水平 腦缺血組大鼠Bax蛋白表達(dá)水平高于正常組Bax蛋白表達(dá)水平(P<0.05)；腦缺血組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯低于正常組Bcl-2蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2、圖2。

表2 兩組大鼠Bax蛋白及Bcl-2蛋白比較(±s) 單位：pg/mL

圖2 Bax蛋白及Bcl-2蛋白免疫組化圖(×100)(A為正常組Bax；B為腦缺血組Bax；C為正常組Bcl-2；D為腦缺血組Bcl-2)

2.3 正常組和腦缺血組神經(jīng)功能評分比較 腦缺血組神經(jīng)功能評分高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組大鼠神經(jīng)功能評分比較(±s) 單位： 分

2.4 正常組和腦缺血組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白情況比較 腦缺血組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3及細(xì)胞自噬率高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4、圖3。腦缺血組大量熒光顆粒顯著多于正常組。在倒置熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量自噬熒光顆粒，這些現(xiàn)象提示可能有自噬發(fā)生。詳見圖4。

表4 兩組大鼠細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白比較(±s)

圖3 Beclin-1、LC3細(xì)胞自噬率電泳圖

圖4 倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞自噬觀察(×400)

3 討 論

腦卒中屬于神經(jīng)科疾病，臨床病死率高達(dá)40%～50%。腦血管病變是其最為主要的發(fā)病原因，高血壓、高血糖、高血脂等都與腦缺血有密切關(guān)系[4]。腦卒中病人大多是在安靜狀態(tài)下突發(fā)起病，突然發(fā)生的局灶性神經(jīng)功能缺失癥候群，損傷的癥狀符合血管分布區(qū)特點(diǎn)，幸存病人中大多留有不同程度的后遺癥[5]，如運(yùn)動型障礙、認(rèn)知型障礙、言語型障礙等后遺癥，這些都極大程度地危害病人身心健康，對病人生活及生存質(zhì)量均造成巨大威脅[6]。

FOXO3a蛋白可以抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，在細(xì)胞衰老的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7]。癌癥中常見FOXO3a基因下調(diào)，腫瘤發(fā)生會造成FOXO3a在機(jī)體內(nèi)的異常表達(dá)，有著密切關(guān)聯(lián)，所以FOXO3被稱為腫瘤抑制器。腦缺血會造成FOXO3a蛋白表達(dá)異常，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。Bcl-2是重要的癌癥基因，對細(xì)胞凋亡具有抑制作用，可以抑制多種細(xì)胞毒作用造成的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡需要信號傳導(dǎo)，存在一個共同的通路途徑，這一途徑主要是依靠Bcl-2控制[9]。DNA損傷之后需要依靠p53蛋白分子起傳導(dǎo)或媒介作用，而Bcl-2抑制p53媒介凋零死亡，但是不能使p53媒介停止生長。Bax蛋白屬于兔抗人單克隆體，是Bcl-2家族里促細(xì)胞凋亡基因。Bax蛋白會在線粒體膜上形成同源二聚體，使細(xì)胞內(nèi)鈣含量過高，誘導(dǎo)各種酶的激活，促使細(xì)胞凋亡。Bcl-2與Bax是相互對立的一對基因，高水平的Bcl-2可以使細(xì)胞對凋亡的抵抗力增強(qiáng)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血大鼠體內(nèi)Bcl-2與Bax水平均存在異常表達(dá)，對機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的生存環(huán)境造成嚴(yán)重影響，從而致使細(xì)胞發(fā)生自噬反應(yīng)。

神經(jīng)系統(tǒng)是人體內(nèi)對生理功能調(diào)節(jié)的主要系統(tǒng)[11]，由神經(jīng)組織組成，分為中樞神經(jīng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)，包括腦和脊髓、腦神經(jīng)和脊神經(jīng)。人體內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能相當(dāng)錯綜復(fù)雜，各個器官的生理過程都不是獨(dú)立完成的，是在神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)配控制下，相互聯(lián)系、影響及配合中完成的[12]。在神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)配下，人體才是一個完整統(tǒng)一的有機(jī)體。腦缺血病人最初神經(jīng)功能受損程度會持續(xù)升高，待達(dá)到頂峰后會有明顯的好轉(zhuǎn)，但最終腦缺血會對病人神經(jīng)系統(tǒng)造成巨大影響及損壞。楊靖等[13]在研究中表明，大鼠腦缺血會對大鼠神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷，與本研究結(jié)果一致，但其研究中腦缺血大鼠神經(jīng)功能評分為(78.2±3.6)分，低于本研究中腦缺血大鼠神經(jīng)功能評分，可能與研究所選取大鼠種類有關(guān)，本研究所選取大鼠為Wistar大鼠，Wistar大鼠是動物實(shí)驗(yàn)大鼠類最為常用及生物醫(yī)學(xué)研究中使用歷史最長的品種，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞自噬是形成雙層膜的自噬泡，將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)包裹起來，然后通過溶酶體融合并消化掉的過程。細(xì)胞自噬只是細(xì)胞在高脅迫的環(huán)境中細(xì)胞自行采取的一種應(yīng)急機(jī)制，目的是在為自身提供營養(yǎng)或者降解掉錯誤折疊蛋白等，細(xì)胞的自噬并不一定會引起細(xì)胞死亡。中性粒細(xì)胞與細(xì)胞的吞噬和消化功能有關(guān)[14]。細(xì)胞自噬在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的參與意義，主要發(fā)揮維持神經(jīng)元功能作用。LC3是酵母自噬相關(guān)基因8，主要存在于哺乳動物中，是自噬體膜特異性重要組成部分。Beclin-1是哺乳動物酵母自噬相關(guān)基因6，在自噬體形成過程中發(fā)揮著重要作用，具有自噬激活象征。腦缺血-缺氧會引起LC3重新分布。

本研究顯示，腦缺血組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3自噬率較高。在倒置熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量自噬熒光顆粒，這些現(xiàn)象說明可能有自噬發(fā)生。此與田雨等[15]研究結(jié)果保持一致。

綜上所述，F(xiàn)OXO3a蛋白在腦缺血損傷中高表達(dá)，Bax蛋白在腦缺血損傷中高表達(dá)，Bcl-2蛋白在腦缺血損傷中低表達(dá)，腦缺血會對神經(jīng)功能造成損傷，并提高細(xì)胞自噬率。FOXO3a蛋白、Bax蛋白、Bcl-2蛋白對腦缺血病人的治療及預(yù)后有重要意義。