C反應(yīng)蛋白基因單核苷酸多態(tài)性和環(huán)境交互作用與缺血性腦卒中的相關(guān)性分析

李曉峰，高永俊，崔重林，楊 旭，李新毅，王 征

炎癥反應(yīng)參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程[1-2]，與缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[3]。C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)作為一種急性時(shí)相炎性蛋白，其血漿濃度與動(dòng)脈粥樣硬化損傷程度呈正相關(guān)[4]。近年來研究報(bào)道認(rèn)為部分CRP基因單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)不僅與血漿水平關(guān)聯(lián)密切[5-6]，且可增加IS的發(fā)生及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[7-9]，但結(jié)果頗有爭議[10-11]。IS的發(fā)生是由遺傳和環(huán)境因素共同作用的疾病，目前公認(rèn)高血壓病、糖尿病、肥胖、吸煙、飲酒等環(huán)境因素與80%的腦卒中發(fā)生相關(guān)[12]。在這些危險(xiǎn)因素中，吸煙、飲酒是血管疾病的主要危險(xiǎn)因素[13-15]。然而既往關(guān)于CRP與吸煙、飲酒交互作用對(duì)腦卒中的影響研究尚少?；诖?，本研究擬通過病例-對(duì)照研究，根據(jù)既往研究陽性結(jié)果及HapMap數(shù)據(jù)庫，篩選CRP基因2個(gè)標(biāo)簽SNP(rs1130864和rs1800947)，探討其基因型、單體型與IS及其亞型發(fā)生的相關(guān)性，并進(jìn)一步探討了SNP與環(huán)境因素交互作用對(duì)IS發(fā)生的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究采用病例對(duì)照研究，IS組病人來源于2010年10月—2011年12月連續(xù)入住北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科病人236例，均為發(fā)病3 d內(nèi)入選，男158例，女78例，年齡(67.14±9.69)歲。診斷依據(jù)全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)頭顱CT或核磁共振(MRI)證實(shí)，并進(jìn)行TOAST分型[16]，其中大動(dòng)脈粥樣硬化型腦卒中(large-artery atherosclerosis，LAA)174例，小動(dòng)脈閉塞性腦卒中或腔隙性腦卒中(small-artery occlusion，SAA)62例。對(duì)照組從同期體檢中心選取非IS病人270例，男153例，女117例，年齡(66.79±6.51)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他類型腦卒中；近3個(gè)月有心、腦及周圍血管疾病史；血液系統(tǒng)疾病、動(dòng)脈炎、結(jié)核、腫瘤、外傷；半個(gè)月內(nèi)有呼吸道、胃腸道等感染史；既往嚴(yán)重肝、腎功能疾病或曾接受過器官移植者。

1.2 方法

1.2.1 信息采集 本研究通過本院倫理委員會(huì)審查，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。采用統(tǒng)一的調(diào)查問卷收集臨床資料，包括年齡、性別、身高、體重、冠心病史、糖尿病史、家族史、吸煙史、飲酒史等。

1.2.2 SNP位點(diǎn)篩選 所有研究對(duì)象采集清晨空腹靜脈血2 mL，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆茫捎肁xyPrep基因組DNA試劑盒提取白細(xì)胞基因組DNA。登錄人類HapMap計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，選擇SNP genotype data下載China Han Beijing(CHB)數(shù)據(jù)，并運(yùn)行Haploview3.0軟件(http：//www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)，在HapMap Format中讀取CHB數(shù)據(jù)，設(shè)置最小等位基因頻率>0.01，以SNPs之間r2>0.8的原則，選擇CRP基因標(biāo)簽SNP位點(diǎn)rs1130864與rs1800947。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及基因分型 采用Premier 5.0進(jìn)行設(shè)計(jì)引物(上海英俊生物技術(shù)公司)，基因分型采用PCR-RFLP。PCR反應(yīng)條件：總體積20 μL，含模板DNA10 ng，1.5UTaq酶，dNTP 0.2 mmol/L，2×PCR緩沖液10 μL，兩種引物上下游引物各1 μL。PCR擴(kuò)增循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共25個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，予以3%瓊脂糖凝膠電泳，PCR 擴(kuò)增結(jié)果采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察。PCR產(chǎn)物由限制性內(nèi)切酶(NEB公司)2 U進(jìn)行消化，65 ℃溫育1 h，以含溴化乙啶的3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物。rs1130864擴(kuò)增段內(nèi)另有2個(gè)酶切位點(diǎn)，測序結(jié)果證實(shí)此位點(diǎn)發(fā)生C>T置換，此次試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)TT基因型。rs1800947經(jīng)PCR 擴(kuò)增及酶切后證實(shí)發(fā)生G>C突變，未發(fā)現(xiàn)CC基因型。詳見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。IS組和對(duì)照組間比較，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。兩組間各SNP基因型分布頻率差異采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。應(yīng)用多因素Logistic回歸校正相關(guān)危險(xiǎn)因素，分析每個(gè)SNP基因型、等位基因?qū)S潛在獨(dú)立作用，并對(duì)基因-環(huán)境交互作用進(jìn)行分析。兩組間單體型分布頻率差異采用unPHASED軟件(Version 3.1.4)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 除年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)外，IS組男性、高血壓病、糖尿病、冠心病、家族腦卒中病史、吸煙史、飲酒史率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 兩組臨床資料比較

2.2 CRP基因SNP與IS及其亞型相關(guān)性 對(duì)照組rs1130864和rs1800947基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，提示具備人群代表性。兩組間rs1130864基因型、等位基因頻率分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組間rs1800947基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[IS組：OR=2.205，95%CI(1.251，3.887)，P=0.005；LAA組：OR=2.178，95%CI(1.189，3.991)，P=0.010；SAA組：OR=2.280，95%CI(1.014，5.127)，P=0.042]。兩組間rs1800947等位基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[IS組：OR=2.102，95%CI(1.212，3.645 )，P=0.007；LAA組：OR=2.079，95%CI(1.156，3.739)，P=0.014]。詳見表3。

表3 SNP與IS及其亞型的相關(guān)性分析

2.3 兩組間單體型分布頻率分析 據(jù)連鎖不平衡系數(shù)>0.5為構(gòu)建單體型標(biāo)準(zhǔn)，CRP基因rs1130864和rs1800947共構(gòu)建3種單體型：C-G、T-G、C-C。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組單體型C-C頻率分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[IS組：OR=2.392，95%CI(1.325，4.320)，P=0.007；LAA組：OR=2.355，95%CI(1.260，4.401)，P=0.013]。詳見表4。

表4 CRP單體型與IS及其亞型相關(guān)性分析

2.4 基因與環(huán)境因素交互作用分析 校正性別(男性)、高血壓病、糖尿病、冠心病、家族腦卒中史后，吸煙病人攜帶rs1800947-GC基因型頻率顯著高于對(duì)照組[OR=6.276，95%CI(2.288，17.221)，P<0.001]，飲酒病人攜帶rs1800947-GC基因型頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR=9.207，95%CI(2.489，34.056)，P= 0.001]。詳見表5。

表5 CRP基因rs1800947與環(huán)境交互作用與IS的相關(guān)性分析

3 討 論

研究表明，CRP作為一種急性時(shí)相炎性因子，與動(dòng)脈粥樣硬化乃至IS的發(fā)生密切相關(guān)[4，17]。血清CRP蛋白水平受遺傳因素的影響[18-19]，Martínez-Calatrava等[20]研究發(fā)現(xiàn)CRP基因rs1205、rs1130864、rs1417938、 rs1800947組成的單倍型CCATGCCT和CTATCCTT可解釋2.9%的總血清水平變異。已有證據(jù)表明，CRP基因部分SNP可作為IS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5-6]。本研究結(jié)果顯示，rs1800947基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示攜帶rs1800947-C等位基因IS組、LAA組的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)分別升高2.102倍、2.079倍，這一結(jié)果雖與Ladenvall 等[21]、Gonzlez-Giraldo等[10]不同，但與Morita 等[7]結(jié)果一致，其團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)GC基因型可作為日本老年人群IS發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。未發(fā)現(xiàn)rs1130864與IS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，與Morita等[7]、Kuhlenbaeumer等[9]研究結(jié)果一致，但美國Arenillas等[8]的一項(xiàng)隊(duì)列研究結(jié)果不同，該研究認(rèn)為rs1130864-T等位基因可作為IS復(fù)發(fā)的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測因子。本研究分析可能是由于研究方法、地域、種族、樣本量、環(huán)境暴露因素等的差異，導(dǎo)致了爭議結(jié)果的產(chǎn)生。本研究以rs1130864與rs1800947之間r2>0.8的原則，進(jìn)行單體型構(gòu)建，結(jié)果顯示IS組單體型C-C頻率顯著高于對(duì)照組，提示單體型C-C趨于整體遺傳，且可作為IS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與Morita等[7]得出的結(jié)論一致，可能是由于共為亞洲人群。盡管本研究并非首例報(bào)道CRP基因SNP與IS的相關(guān)性研究，但基于既往研究結(jié)果不一致，從這項(xiàng)研究中獲得的結(jié)果對(duì)于理解IS的機(jī)制是必要的，特別是對(duì)于CRP基因SNP與環(huán)境交互作用導(dǎo)致的IS易感性。

IS是由多種基因和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[22]，推測CRP基因SNP(rs1800947)與環(huán)境因素(吸煙、飲酒)在IS發(fā)生過程中存在顯著的交互作用。通過多元Logistic回歸發(fā)現(xiàn)吸煙者攜帶rs1800947 GC 基因型IS發(fā)病率顯著升高，這一結(jié)論與Wu等[23]結(jié)論相似，其團(tuán)隊(duì)曾采用基因廣義的多因素降維法和多元Logistic回歸，發(fā)現(xiàn)CRP基因rs2794521和吸煙存在顯著交互作用，吸煙者攜帶rs2794521-AA基因型較rs2794521-AG或GG基因型IS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。吸煙是動(dòng)脈粥樣硬化乃至IS的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素之一，其可能損害血管內(nèi)皮細(xì)胞，減少血管舒張因子，上調(diào)縮血管物質(zhì)，并刺激肝細(xì)胞合成 CRP，二者可協(xié)同促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化及血栓形成[24-25]。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，大量飲酒者攜帶rs1800947-GC基因型IS發(fā)病率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示rs1800947-GC基因型與飲酒在IS的發(fā)生中存在顯著的交互作用。大量飲酒不僅引發(fā)血糖和血脂的代謝紊亂促進(jìn)動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展，還可促進(jìn)白細(xì)胞介素-6(IL-6)釋放，誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生急性時(shí)相蛋白CRP，通過改變血液凝固和纖維蛋白溶解等機(jī)制而增加 IS 的易患性。

本研究中亦存在一定的局限性。首先，采用病例對(duì)照研究，樣本量偏小，不可避免地存在該研究類型局限性，需要謹(jǐn)慎分析結(jié)果，尚需進(jìn)一步進(jìn)行大樣本前瞻性研究去證實(shí)；僅篩選了CRP基因兩個(gè)突變頻率較高的SNP，在以后研究中可考慮納入更多的標(biāo)簽SNP。

rs1130864與IS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)，CRP基因rs1800947-GC基因型、單體型C-C與IS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，可能是影響IS發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。CRP基因rs1800947-GC基因型與吸煙、飲酒存在IS發(fā)生過程中顯著的交互作用。