宏基因組二代測序法診斷細菌性腦膜炎的應用價值

尚 晶，上官麗娟，王燕宏，牛爭平，楊麗白，侯苗苗，薛嵐平

細菌性腦膜炎(bacterial meningitis，BM)是由細菌感染所致的嚴重中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，常表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、嘔吐，嚴重者可出現(xiàn)譫妄、昏迷、呼吸衰竭等。近年來，細菌性腦膜炎的發(fā)病率呈上升趨勢，據(jù)報道2013年全球該病發(fā)病率為每年1 300萬人，其中160萬人遺留不同程度的后遺癥[1]。細菌性腦膜炎的高致死性及致殘性，給社會和病人家庭造成嚴重的經(jīng)濟負擔，嚴重影響病人及家庭的生活質(zhì)量[2]。早期、及時的病原學診斷，可以指導臨床醫(yī)生準確選擇抗菌藥物，對于減輕病人的病情嚴重程度及改善預后具有重要意義，因此，對該病致病菌的確定至關(guān)重要。

目前，臨床最常用的腦脊液細菌學培養(yǎng)是診斷細菌性腦膜炎的主要方法，將腦脊液病原菌進行分離、培養(yǎng)及鑒定，但其陽性率低、工作量大、耗時較長，不能及時提供可靠的診斷依據(jù)，不利于疾病的早期有效干預，導致不良預后，在臨床應用中存在較大的局限性。近年來，隨著檢測技術(shù)的進步，二代測序以其“高通量優(yōu)勢”在臨床中廣泛應用，宏基因組二代測序法在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染疾病病原學檢出率及診斷水平提高中發(fā)揮重要作用，目前已應用于細菌性腦膜炎的診斷。本研究對山西某三級甲等醫(yī)院2016年1月—2020年5月臨床診斷為細菌性腦膜炎的41例病人進行回顧性分析，分析腦脊液培養(yǎng)與宏基因組二代測序方法的敏感性，探討宏基因組二代測序技術(shù)與傳統(tǒng)檢測方法在細菌性腦膜炎病人腦脊液中提供病原學證據(jù)的效能差異及早前臨床診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2016年1月—2020年5月在山西某三級甲等醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院病人41例，由臨床表現(xiàn)及腦脊液常規(guī)、生化檢查初診為細菌性腦膜炎，且行腦脊液培養(yǎng)或宏基因組二代測序治療，均符合診斷標準。本研究遵循山西某三級甲等醫(yī)院機構(gòu)審查委員會、人體標本使用指南和法規(guī)建議，遵循《赫爾辛基宣言》，所有研究對象及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準 ①病人存在腦膜炎、腦炎或腦脊髓炎的臨床表現(xiàn)或體征；②腦脊液化驗符合細菌性腦膜炎變化特點；③病原學證據(jù)，包括細菌涂片檢出病原菌、血細菌培養(yǎng)陽性等。

1.3 研究方案 回顧性分析41例病人臨床資料，分析其臨床表現(xiàn)、實驗室與影像資料特點，根據(jù)病原菌檢查方式的不同，在征得病人或其家屬意見后將病人分組，腦脊液培養(yǎng)組及宏基因組二代測序組(包括腦脊液培養(yǎng)陰性者)，比較兩組檢測方法的陽性檢出率及臨床預后等。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床特點 腦脊液培養(yǎng)組，41例病人中有39例行常規(guī)腦脊液細菌培養(yǎng)，年齡16～82(46.72±16.95)歲；男22例，女17例；37例以發(fā)熱起病，25例之前有上呼吸道感染表現(xiàn)；9例有顱腦外傷、腦脊液鼻漏，2例有高血壓及糖尿病，7例有高血壓，1例有糖尿病，3例有中耳炎，1例有風濕系統(tǒng)疾??；7例起病時有癇性發(fā)作，其中6例為部分性繼發(fā)全面性發(fā)作，1例為單純部分性發(fā)作；31例存在不同程度意識障礙，其中嗜睡13例，昏睡7例，昏迷 11例；腦膜刺激征陽性21例。

宏基因組二代測序組，41例病人中有15例行腦脊液宏基因組二代測序，年齡23～82(51.64±17.63)歲；男9例，女6例；其中13例以發(fā)熱起病，8例病前有上呼吸道感染表現(xiàn)；3例有顱腦外傷、腦脊液鼻漏，2例有高血壓及糖尿病，4例有高血壓，1例有糖尿病，1例有風濕系統(tǒng)疾病；3例起病時有癇性發(fā)作，3例均為部分性繼發(fā)全面性發(fā)作；13例存在不同程度意識障礙，其中嗜睡5例，昏睡3例，昏迷5例；腦膜刺激征陽性9例。詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 實驗室檢查結(jié)果 所有病例均完善血細胞分析、C反應蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)、肝功能、腎功能、電解質(zhì)及腦脊液常規(guī)、生化等基礎(chǔ)檢驗項目，39例病人均出現(xiàn)白細胞計數(shù)(WBC)及中性粒細胞計數(shù)增高，均存在不同程度CRP、PCT 增高，腦脊液中WBC增高，腦脊液蛋白出現(xiàn)不同程度增高。兩組病人實驗室檢查結(jié)果見表2。

表2 兩組病人實驗室檢查結(jié)果比較(±s)

2.3 影像學檢查 41例病人中5例行頭部CT檢查，未見異常；39例完善頭顱核磁共振(MRI)+DWI檢查，其中23例出現(xiàn)影像學異常，1例為硬膜下積膿，22例表現(xiàn)為蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)異常信號。

2.4 病原學檢查 41例病人中39例行腦脊液培養(yǎng)，有6例明確了病原體，其中4例肺炎鏈球菌，2例單核細胞增生性李斯特菌，腦脊液培養(yǎng)組陽性檢出率為15.38%。41例病人中15例進行了腦脊液二代測序，其中13例為常規(guī)腦脊液培養(yǎng)為陰性的病人；8例明確了病原菌，其中5例為肺炎鏈球菌，3例為單核細胞增生性李斯特菌；宏基因組二代測序組陽性檢出率為53.33%。兩組陽性檢出率比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明宏基因組二代測序檢出敏感度高于腦脊液培養(yǎng)組。詳見表3。

表3 41例細菌性腦膜炎病人腦脊液宏基因組二代測序與腦脊液培養(yǎng)結(jié)果比較 單位：例

2.5 轉(zhuǎn)歸及預后 本研究41例病人中有8例出現(xiàn)預后不良，其中明確病原菌的病人預后相對較好(14例中僅2例預后差)，而未明確病原菌的病人預后差(27例中有6例預后差)。余病人均恢復良好，無明顯后遺癥。詳見表4。

表4 8例預后不良細菌性腦膜炎病人基本狀況

3 討 論

細菌性腦膜炎是一種危及生命的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，致殘率和致死率均很高。導致社區(qū)獲得性細菌性腦膜炎最常見的病原體為肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌和單核增生李斯特菌，分別占70%、10%和5%[3-6]。病原菌常常侵襲力強，可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)軟腦膜，腦、脊髓實質(zhì)，或感染臨近的組織如靜脈竇、周圍神經(jīng)等，其主要臨床表現(xiàn)為感染癥狀、腦膜刺激征、顱內(nèi)壓增高及局灶癥狀等，實驗室檢查多表現(xiàn)為血白細胞計數(shù)增加，腦脊液壓力升高、白細胞計數(shù)明顯升高，蛋白質(zhì)升高及糖含量下降。臨床確診需有病原學證據(jù)，如傳統(tǒng)的細菌涂片檢出病原菌、腦脊液或血培養(yǎng)陽性等。

本研究中41例病人臨床及腦脊液常規(guī)生化等檢驗結(jié)果符合細菌性腦膜炎表現(xiàn)，30例為危重癥病人，但病原菌不明，致使臨床準確診斷及治療困難。本研究腦脊液宏基因組二代測序檢出陽性率可達53.33%，而傳統(tǒng)腦脊液培養(yǎng)檢出陽性率僅為15.38%，宏基因組二代測序結(jié)果不僅證實了初期的診斷，同時精準確定了病原菌，使治療方向性更加明確，調(diào)整敏感抗菌藥物，病人獲得良好預后，減輕了病人的經(jīng)濟負擔。本組有1例二代測序為單核細胞增生性李斯特菌的病人并發(fā)腦積水死亡，可能是因為病人發(fā)病早期基于常規(guī)腦脊液培養(yǎng)為陰性之后，進行的二代測序，延誤了確診和有針對性的抗菌藥物應用治療時機，提示應盡早進行二代測序檢查，以減少并發(fā)癥的發(fā)生和降低死亡率。

目前細菌性腦膜炎病原體檢測方法包括腦脊液細菌涂片、培養(yǎng)、抗原檢測等，但總體陽性率不高，60%～85%的病人不能獲得明確的病原學診斷[7-8]。多數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病人病情危急，臨床上多以腦脊液壓力、外觀、腦脊液常規(guī)與生化等實驗室結(jié)果進行經(jīng)驗性診斷與治療，造成初期治療選擇抗菌素的級別越來越高，容易造成抗菌素選擇的盲目性與病原微生物的耐藥[9-10]。自2005年宏基因組二代測序技術(shù)出現(xiàn)后，其優(yōu)點日益突出，可以準確、高效地完成病原體檢測，該技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病病原學的診斷方面逐漸顯示出較其他傳統(tǒng)診斷方法的優(yōu)越性，在腦脊液常見的病毒、細菌、寄生蟲感染中較傳統(tǒng)檢驗方法有較高的敏感性及特異性，腦脊液宏基因組二代測序已經(jīng)成功應用于臨床，對于新發(fā)病原體的鑒定具有重要作用[11-12]。但因宏基因組二代測序技術(shù)應用于顱內(nèi)感染時間較短，尚缺少大樣本的臨床研究結(jié)論，目前宏基因組二代測序技術(shù)診斷單個病原體的標準尚不明確[13]，不同研究報道的診斷標準不一致[14]，主要參考覆蓋度、病原體相對豐度或病原體的特異讀數(shù)來制定[15]，尚需更多的數(shù)據(jù)及研究來制定統(tǒng)一檢驗診斷標準。