POLG 基因變異致線粒體病一家系分析

彭炳蔚 曾意茹 侯 池 梁惠慈 陳文雄 李小晶

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心神經(jīng)內(nèi)科（廣東廣州 510623）

POLG基因編碼DNA 多聚酶γ 的一個(gè)催化亞基（p 140），該酶是線粒體內(nèi)唯一的DNA 聚合酶，負(fù)責(zé)線粒體DNA 復(fù)制。POLG基因變異將導(dǎo)致DNA 多聚酶γ 的催化活性、持續(xù)合成能力以及與DNA 結(jié)合能力嚴(yán)重下降，影響mtDNA 的保真性復(fù)制以及mtDNA 結(jié)構(gòu)完整性的維護(hù)，導(dǎo)致mtDNA 的多發(fā)性片段缺失、多發(fā)點(diǎn)突變或拷貝數(shù)減少，mtDNA 編碼線粒體呼吸鏈的13 種蛋白，與人類能量代謝息息相關(guān)。因此，POLG基因變異將導(dǎo)致線粒體功能異常而引發(fā)線粒體疾病[1]。POLG相關(guān)線粒體病目前常見5 種表型：①Alpers-Huttenlocher 綜合征（Alpers-Huttenlocher syndrome，AHS）；②兒童肌肉萎縮性肝病譜（myocerebrohepatopathyspectrum，MCHS）；③肌陣攣性癲癇肌病感覺(jué)性共濟(jì)失調(diào)（myoclonic epilepsymyopathy sensory ataxia，MEMSA）；④共濟(jì)失調(diào)神經(jīng)病譜（ataxia neuropathy spectrum，ANS）；⑤進(jìn)行性眼外肌麻痹（progressive external ophthalmoplegia，PEO），伴或不伴感覺(jué)性共濟(jì)失調(diào)神經(jīng)病及構(gòu)音障礙（sensory ataxic neuropathy and dysarthria，SANDO）[2]。但目前為止，國(guó)內(nèi)鮮有POLG基因變異相關(guān)的感覺(jué)性共濟(jì)失調(diào)神經(jīng)病家系報(bào)道[3]。現(xiàn)報(bào)告1 例POLG基因變異所致的線粒體病家系，并復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)，探討疾病的臨床診斷線索。

1 臨床資料

先證者，男，10 歲，因抽搐3 次，雙下肢乏力1 周收住于廣州市婦女兒童醫(yī)療中心。入院前1周患兒無(wú)明顯誘因于凌晨睡眠中出現(xiàn)抽搐1 次，表現(xiàn)為呼之不應(yīng)，雙眼向上凝視，牙關(guān)緊閉，雙手握拳，四肢抖動(dòng)，無(wú)口周發(fā)紺、口吐白沫、嘔吐、口角歪斜、大小便失禁，持續(xù)約2～3分鐘后自行緩解。間隔10分鐘后，患兒再次出現(xiàn)類似發(fā)作。緩解后患兒精神困倦，雙下肢乏力，不能獨(dú)走。至當(dāng)?shù)蒯t(yī)院急診，就診過(guò)程中患兒再次抽搐發(fā)作，予安定止痙處理后緩解。之后患兒仍雙下肢乏力，不能行走，非晨輕暮重，無(wú)肌肉酸痛。

患兒為G4P4，雙胎之小，孕37+周順產(chǎn)，出生體質(zhì)量2.45 kg，無(wú)窒息搶救史，生后因低出生體質(zhì)量?jī)涸诋?dāng)?shù)蒯t(yī)院新生兒科住院治療1 周（具體不詳）。2 歲起因腹痛多次于外院治療。本次就診前半月有發(fā)熱、咳嗽。患兒從小偏瘦小，運(yùn)動(dòng)能力欠佳，平日易摔跤、易疲勞，生長(zhǎng)發(fā)育落后于同齡兒?，F(xiàn)小學(xué)四年級(jí)，成績(jī)中下等。母親孕期無(wú)特殊。父母體健，非近親婚配。1 個(gè)哥哥、2 個(gè)姐姐均在1 歲多時(shí)因發(fā)熱夭折，病因未明。先證者同胎胞兄生長(zhǎng)發(fā)育也落后于同齡兒，常訴腹痛，無(wú)抽搐史和肌無(wú)力病史。家族中無(wú)其他疾病史。

入院體格檢查：身高130 cm（<2 SD），體質(zhì)量21.8 kg（< 2 SD）；神志清，精神倦，反應(yīng)可；胸式呼吸減弱，心臟聽診心律不齊；腹部無(wú)異常；顱神經(jīng)檢查：雙側(cè)眼瞼無(wú)下垂，雙側(cè)眼裂對(duì)稱，雙側(cè)眼球運(yùn)動(dòng)正常，雙側(cè)瞳孔等大等圓，直徑約3 mm，對(duì)光反射靈敏，雙側(cè)額紋對(duì)稱，口角無(wú)歪斜，吞咽正常，無(wú)嗆咳，懸雍垂居中，雙側(cè)腭咽弓對(duì)稱；舌肌邊緣可見輕度萎縮，伸舌居中、無(wú)震顫。痛覺(jué)、溫覺(jué)正常，位置覺(jué)有損害，閉目難立征（+）。站立不穩(wěn)，行走不穩(wěn)，可扶走，足下垂，大小魚際肌欠豐滿，肋間肌可疑萎縮，四肢肌張力無(wú)異常，雙上下肢近端肌力Ⅳ+級(jí)、遠(yuǎn)端肌力Ⅳ級(jí)；指鼻輪替跟膝脛試驗(yàn)尚穩(wěn)準(zhǔn)。角膜反射、咽反射無(wú)異常，腹壁反射可引出；肱二頭肌反射、肱三頭肌反射、橈反射、膝反射、踝反射均未引出；雙側(cè)Babinski征，Hoffmann征等病理征陰性；無(wú)頸抵抗，腦膜刺激征陰性。實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)、生化（包括肝腎功能、血脂）、糞便分析、尿液分析、凝血功能、免疫功能、乙肝、梅毒、艾滋病病原檢查均無(wú)異常，病原學(xué)檢查均為陰性。腦脊液常規(guī)：白細(xì)胞3×106/L，蛋白弱陽(yáng)性（+）；腦脊液生化：微量蛋白1.75 g/L，乳酸脫氫酶187 U/L，糖、氯無(wú)異常。血?dú)夥治觯喝樗? mmol/L、血乳酸/丙酮酸比值10，及腦脊液乳酸/丙酮酸比值27.4（參考值：15～20）。腦電圖（EEG）示背景活動(dòng)雙側(cè)額區(qū)多量4～5 Hz慢活動(dòng)及偶發(fā)尖波。腦干誘發(fā)電位：雙側(cè)Ⅲ、Ⅴ波潛伏期及雙側(cè)Ⅰ～Ⅲ、Ⅰ～Ⅴ波間期延長(zhǎng)。視覺(jué)誘發(fā)電位：雙側(cè)視覺(jué)傳導(dǎo)通路無(wú)異常。肌電圖（electromyography，EMG）示神經(jīng)傳導(dǎo)速度（nerve conduction velocity，NCV）示上、下肢感覺(jué)傳導(dǎo)波幅降低，雙側(cè)腓總神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)波幅度降低，雙脛神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)“腘窩-踝”見可疑波形離散。上、下F波異常。心電圖示竇性心律明顯不齊，偶見竇性靜止；偶發(fā)Ⅱ度Ⅰ型房室傳導(dǎo)阻滯；偶發(fā)室性早搏。心臟彩超無(wú)異常。腹部立臥位X線片示：結(jié)腸內(nèi)糞便淤積。頭顱磁共振（MRI）：輕度萎縮改變。全脊柱MRI：胸3 椎體蝴蝶椎畸形。韋氏智力測(cè)試：智商（IQ）72。

結(jié)合患兒為學(xué)齡期兒童，急性四肢進(jìn)行性無(wú)力，肌張力減低，腱反射消失，腦脊液蛋白細(xì)胞分離，入院后曾考慮急性格林-巴利綜合征可能，予以人免疫球蛋白2 g靜脈滴注，甲基潑尼松龍10 mg/kg沖擊治療5 日，但患兒肌無(wú)力表現(xiàn)無(wú)任何改善，甚至出現(xiàn)呼吸節(jié)律不整，心率減慢，心律不齊?；純鹤孕∫灼?，血乳酸稍高、血及腦脊液乳酸/丙酮酸均稍增高，腦脊液的乳酸脫氫酶異常增高，還伴癲癇發(fā)作、消化道癥狀、聽力損害、心臟傳導(dǎo)異常多系統(tǒng)損害，考慮能量代謝異?？赡?。遂給予每日大劑量B族維生素（維生素B1100 mg、維生素B6100 mg、維生素B12100 mg、維生素B2片20 mg,tid）、維生素E 50 mg (qd)、左卡尼汀10 mL(tid)、能氣朗10mg (tid)、葉酸5 mg (qd)、磷酸肌酸鈉1 g (bid)的能量合劑治療，3天后患兒開始恢復(fù)直至發(fā)病前水平。心電圖恢復(fù)正常，暫無(wú)抽搐，予以出院。出院前復(fù)查腦脊液無(wú)變化。

患兒同胞哥哥也自小易腹痛，從小偏瘦小，運(yùn)動(dòng)能力欠佳，平日易摔跤、易疲勞，生長(zhǎng)發(fā)育落后于同齡兒。現(xiàn)小學(xué)四年級(jí)，成績(jī)中下等。除了無(wú)抽搐外，與先證者有類似臨床癥狀。同胞哥哥體格檢查與先證者相同的體征：深感覺(jué)受損，腱反射消失，肌肉可疑萎縮。

為明確病因，經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理審核以及家屬知情同意，取先證者及其父母、雙胞胎哥哥外周血各2 mL，EDTA 抗凝。首先獲得基因組DNA，PCR 擴(kuò)增目前報(bào)道的醫(yī)學(xué)外顯子、外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)，已報(bào)道有致病的內(nèi)含子區(qū)，父母、先證者同時(shí)進(jìn)行二代測(cè)序，并予以進(jìn)一步一代驗(yàn)證，其哥哥僅采用Sanger 一代驗(yàn)證。另外獲得整個(gè)線粒體基因組，被一個(gè)長(zhǎng)片段PCR反應(yīng)擴(kuò)增，之后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，采用最新的劍橋版線粒體基因組（rCRS NC_012920）作為參考序列，平均覆蓋深度5338+/－506×,編碼區(qū)變異異質(zhì)性或突變負(fù)荷的檢驗(yàn)敏感度>2%。檢查結(jié)果未顯示線粒體組基因的致病變異，但顯示先證者及哥哥POLG基因均存在c.2558>A（p.R853Q）、c.2890>T（p.R 964 C）復(fù)合雜合變異；c.2558>A（p.R 853 Q）來(lái)源于患兒父親，c.2890>T（p.R964C）來(lái)源于患兒母親。見圖1。這2 個(gè)錯(cuò)義變異均被報(bào)道過(guò)，相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這2個(gè)變異會(huì)影響蛋白功能，p.R853Q人群頻率<0.001,p.R964C東亞人群頻率0.009。計(jì)算機(jī)輔助分析預(yù)測(cè)這2 個(gè)變異影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)/功能可能性大。根據(jù)美國(guó)大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)（American College of Medical Genetics，ACMG）變異分類指南，這2個(gè)變異為2類可能致病和3類意義未明。

患兒出院后繼續(xù)能量合劑治療，仍出現(xiàn)2 次部分繼發(fā)全面性的發(fā)作，遂以左乙拉西坦0.125 g，q12h，1周后加量至0.375 g，q12h，對(duì)癥抗驚厥，仍間有發(fā)作，給予生酮飲食至今3個(gè)月臨床無(wú)發(fā)作。

圖1 POLG 基因變異Sanger 一代驗(yàn)證結(jié)果

2 討論

本例患兒就診時(shí)急性起病，先抽搐，隨之出現(xiàn)肌無(wú)力表現(xiàn)，最初并沒(méi)有考慮代謝性疾病。應(yīng)用人丙種球蛋白及大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊治療，均未能改善癥狀。雖然患兒有周圍神經(jīng)病的癥狀體征，腦脊液也有蛋白細(xì)胞分離，然而腦脊液的乳酸脫氫酶異常增高卻在常見的脫髓鞘疾病中十分罕見。更重要的是，患兒舌肌邊緣輕度萎縮，大小魚際肌欠豐滿，肋間肌可疑萎縮，難以用急性疾病解釋。由于家長(zhǎng)提及患兒常訴腹痛，也懷疑過(guò)是否因消化道異常導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的可能。同時(shí)患兒聽力損害、心臟傳導(dǎo)異常，高度提示可能累及多系統(tǒng)疾病的可能?；純鹤孕∫灼?，血?dú)夥治鍪救樗嵘愿摺⒀澳X脊液乳酸/丙酮酸均稍增高，提示能量代謝異常。通過(guò)嘗試大劑量能量合劑治療，患兒獲得恢復(fù)。另外患兒父母的不良生育史，以及其雙胞胎（同卵雙胎）哥哥相似的癥狀，高度提示患兒存在特定的遺傳性疾病的可能。進(jìn)一步篩查患兒線粒體組基因，并進(jìn)行家系的二代測(cè)序和一代驗(yàn)證，最終明確患兒存在POLG基因c.2558>A（p.R853Q）、c.2890>T（p.R964C）復(fù)合雜合變異。本例患兒經(jīng)詳細(xì)的體格檢查為疾病診斷奠定了基礎(chǔ)，基因檢查則更進(jìn)一步印證了臨床判斷，同時(shí)通過(guò)家系追蹤分析，更深一步解釋患兒病情，為臨床精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

POLG相關(guān)疾病發(fā)病年齡可以從嬰兒期到成年晚期，可能導(dǎo)致從中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)、眼外肌、視力、聽力乃至心臟傳導(dǎo)、肝臟、胃腸道多個(gè)系統(tǒng)的癥狀。需要提及的是，POLG相關(guān)疾病患兒的胃腸道癥狀常表現(xiàn)為胃腸動(dòng)力不足，本家系中2 例患兒均因結(jié)腸糞便淤積而常訴腹痛[2,4]。雖然在臨床研究中常常根據(jù)其癥狀分為AHS、MCHS、MEMSA、PEO和SANDO，五種類型，但實(shí)際上患兒常有多樣的癥狀，而不限于表型所描述的典型癥狀[2.4]。研究表明，POLG相關(guān)疾病患兒的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀中，周圍神經(jīng)病的發(fā)生率最高，66%有腱反射減弱或消失、振動(dòng)覺(jué)減弱或消失，可以為EMG證實(shí)；然后依次是小腦運(yùn)動(dòng)障礙（60%）、眼外肌（45%）、肌無(wú)力（32%）、認(rèn)知障礙（32%）、精神癥狀（21%）、癲癇（14%），周圍神經(jīng)病對(duì)其診斷的敏感性高達(dá)94%。因此，多系統(tǒng)損害伴感覺(jué)性共濟(jì)失調(diào)神經(jīng)病是提示POLG相關(guān)線粒體病的重要臨床特征[4]。需要提及的是，本家系中先證者同胞哥哥無(wú)特別的主訴癥狀，是通過(guò)家系追蹤詳細(xì)查體而獲得臨床證據(jù)。

迄今為止，關(guān)于POLG基因全球范圍內(nèi)已經(jīng)有超過(guò)300個(gè)突變位點(diǎn)在病例中被報(bào)道[5]。國(guó)內(nèi)也有散發(fā)的ANS[3]及AHS 家系[6]的報(bào)道。目前除了PEO 有部分是常染色體顯性遺傳外，其余均為常染色體隱性遺傳[5,7]。由于常隱遺傳，突變位點(diǎn)的組合十分復(fù)雜，確定基因型和表型的相關(guān)性十分困難。目前在對(duì)POLG基因變異相關(guān)的癲癇患者的分析中發(fā)現(xiàn)，84%帶有p.A467T、p.T748S及p.G848S位點(diǎn)變異[8]。本例患兒也有癲癇，卻沒(méi)有上述3個(gè)位點(diǎn)變異?？梢?，POLG基因型與表型的研究仍需深入。

本家系中的2 個(gè)變異位點(diǎn)均有報(bào)道[9-10]，其中p.R853Q被報(bào)道與AHS及MCHS 有關(guān)[5.9]，是POLG相關(guān)疾病中最嚴(yán)重的一種表型，發(fā)病年齡最早，常發(fā)生在嬰兒期，快速進(jìn)展，常導(dǎo)致死亡。本家系已有3個(gè)孩子均在1歲多發(fā)熱后死亡。POLG相關(guān)疾病所引起的嚴(yán)重病變常在一些生理誘發(fā)因素下爆發(fā)，特別與病毒感染誘發(fā)的高熱有密切關(guān)系。因此本家系的前3個(gè)孩子不排除AHS 及MCHS。由于前3 個(gè)孩子的夭折，本例患兒自小受到家長(zhǎng)細(xì)心的照顧，基本沒(méi)有得過(guò)發(fā)熱性的疾病，也許是存活至今的重要原因。p.R964C則被報(bào)道與ANS 或SANDO 有關(guān)[5.9]。本家系中先證者及同胞哥哥均可以診斷為ANS，但目前尚無(wú)眼肌麻痹的臨床表現(xiàn)。先證者及同胞哥哥為同卵雙胎，經(jīng)確證為相同基因變異，養(yǎng)育環(huán)境也基本相似，但在表型上也略有差異。1例有癲癇發(fā)作，而另1例沒(méi)有。由此可見，對(duì)于POLG基因變異相關(guān)疾病，即使是同一位點(diǎn)變異，其表型和嚴(yán)重程度也會(huì)有差異，且與發(fā)病年齡密切相關(guān)[11]，感染、藥物、毒素被認(rèn)為是常見的誘發(fā)因素?？股仡愃幬锍０殡S感染一并使用，由于感染增加能量耗竭，而抗生素又抑制線粒體功能，可導(dǎo)致出現(xiàn)嚴(yán)重情況[12]。除此之外，復(fù)合雜合變異與表型之間的關(guān)聯(lián)在該家系中也有所提示，該家系中的個(gè)體分別出現(xiàn)了2種變異導(dǎo)致的癥狀，也可能存在一些調(diào)控機(jī)制，導(dǎo)致致病基因表達(dá)隨年齡差異，尚需要進(jìn)一步研究。

POLG相關(guān)疾病尚無(wú)有效的治療手段，主要采用支持和對(duì)癥處理。POLG相關(guān)的癲癇需避免使用丙戊酸，生酮飲食對(duì)癲癇控制有幫助[2]。POLG變異者在使用退熱藥時(shí)也需要小心，阿司匹林類藥物退熱易導(dǎo)致急性肝腦綜合征的可能。本家系中的前3個(gè)孩子均死于發(fā)熱，是否與用藥有關(guān)，值得探討。本例患兒經(jīng)過(guò)能量合劑支持治療獲得肌無(wú)力癥狀及心臟傳導(dǎo)改善，生酮飲食使其癲癇發(fā)作暫時(shí)得到控制，但是最終的預(yù)后還需要更長(zhǎng)期隨訪。

綜上，本研究揭示POLG相關(guān)疾病即使同種基因型臨床異質(zhì)性也較大，在同一家系，甚至同卵雙胎患兒中都可能存在不同的臨床表型。然而，POLG基因變異相關(guān)疾病雖然臨床表型復(fù)雜，嚴(yán)重程度不一，但是感覺(jué)性共濟(jì)失調(diào)神經(jīng)病是其特征性表現(xiàn)，但遺憾的是易被忽略。仔細(xì)的體格檢查可發(fā)現(xiàn)POLG基因變異相關(guān)疾病癥狀，使患者獲得更早期的診斷。