• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    油棕WRKY轉錄因子的全基因組鑒定與分析

    2020-08-26 15:00:26周麗霞曹紅星
    廣西植物 2020年7期
    關鍵詞:油棕表達分析生物信息學

    周麗霞 曹紅星

    摘?要:該研究從NCBI網站下載油棕全基因組序列信息,從The?Arabidopsis?Information?Resource(TAIR)數據庫中下載得到擬南芥WRKY轉錄因子序列,并在油棕基因組數據庫中進行BLAST同源序列比對分析,通過NCBI在線工具CDD和PFAM數據庫進行蛋白結構與分析,剔除無WRKY結構域的系列,利用生物信息學方法對油棕WRKY轉錄因子進行分析及功能預測。結果表明:(1)從油棕基因組數據庫中發(fā)掘WRKY轉錄因子95個,該WRKY轉錄因子蛋白質所編碼氨基酸大小為116~1?303?bp,95個均為親水性蛋白,總體為不穩(wěn)定蛋白(EgWRKY25和EgWRKY56除外),60個蛋白以α-螺旋為主要二級結構元件,35個以無規(guī)卷曲為主要二級結構元件。(2)保守結構域系統(tǒng)進化樹結果表明,油棕WRKY轉錄因子家族蛋白主要分為三大類,即I、Ⅱ和Ⅲ類,其中I類分為I?C、I?N亞類,Ⅱ類分為Ⅱ?a、Ⅱ?b、Ⅱ?c和Ⅱ?d亞類。(3)內含子和外顯子結構顯示,EgWRKY基因結構進化高度保守。以上結果為油棕WRKY轉錄因子的挖掘、功能分析及分子生物學研究奠定了基礎,同時為分子育種和遺傳改良提供了參考。

    關鍵詞:油棕,基因組,WRKY轉錄因子,生物信息學,表達分析

    中圖分類號:Q943

    文獻標識碼:A

    文章編號:1000-3142(2020)07-0977-11

    Abstract:Genome-wide?sequence?information?of?oil?palm?from?NCBI?website,and?the?WRKY?transcription?factor?sequence?from?The?Arabidopsis?Information?Resource?(TAIR)?Database?were?downloaded,BLAST?homology?sequence?alignment?analysis?was?carried?out?in?oil?palm?genome?database.?Protein?structure?and?analysis?were?carried?out?through?CDD?and?PFAM?database?of?NCBI?online?tool,and?the?series?without?WRKY?domain?were?eliminated.?Bioinformatics?analysis?and?functional?prediction?of?WRKY?transcription?factor?in?oil?palm.?The?results?were?as?follows:(1)?A?total?of?95?EgWRKY?transcription?factors?were?excavated,and?they?encoded?116-1?303?bp?amino?acids,predicting?hydrophilic?and?unstable?(except?for?EgWRKY25?and?EgWRKY56).?The?main?structure?of?60?EgWRKY?proteins?was?α-helix,and?the?remaining?35?proteins?were?irregular?curl.?(2)?The?phylogenetic?analysis?on?conserved?domain?showed?that?EgWRKY?transcription?factor?family?proteins?were?divided?into?three?categories?(I,Ⅱ?and?Ⅲ).?Category?I?could?be?separated?into?I?C?and?I?N,and?Category?Ⅱ?was?classified?into?Ⅱ?a,Ⅱ?b,Ⅱ?c?and?Ⅱ?d.??(3)?The?intron-exon?structure?analysis?revealed?that?structures?of?EgWRKY?gene?were?highly?conserved.?This?research?will?lay?a?foundation?for?the?study?of?WRKY?transcription?factor?exacavation,function?analysis,and?molecular?biology?of?oil?palm?and?provide?references?for?its?genetic?modification?and?molecular?breeding.

    Key?words:oil?palm,genome,WRKY?transcription?factors,bioinformatics,expression?and?analysis

    植物經過長期的進化,自身形成了一套對抗不良環(huán)境的適應機制,植物受到脅迫后,通過相應的信號傳遞途徑,誘導相關基因的表達以抵御脅迫,而基因的表達受到轉錄因子的調控(謝政文等,2016)。轉錄因子又稱反式作用因子,其作為一類重要的調控基因,主要通過與基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件結合來發(fā)揮調控作用,近年來已成為基因挖掘與功能分析領域的研究熱點(賈翠玲和侯和勝,2010)。轉錄因子的特點為含有DNA結合域、轉錄調控區(qū)、核定位信號區(qū)及寡聚化位點等結構。根據DNA結合域結構的不同,轉錄因子又可分為MYB、WRKY、NAC、Zinx?finger(鋅指蛋白)等諸多家族(伍林濤等,2013)。

    WRKY作為植物中最大的轉錄因子家族之一,通過結合植物次生代謝產物合成途徑關鍵酶基因的啟動子元件來調控植物的代謝過程(丁蒙蒙等,2018)。WRKY的N-末端具有7個高度保守氨基酸殘基WRKYGQK,C端有1個非典型的鋅指結構,其結構域由近60個氨基酸組成。根據WRKY結構域的數目及鋅指結構的類型,WRKY蛋白可分為三個類型:第一類為含有2個WRKY結構域,鋅指結構的類型為C2H2;第二類為含有1個WRKY結構域,鋅指結構的類型為C2H2;第三類為含有1個WRKY結構域,鋅指結構的類型為C2HC(伍林濤等,2013)。WRKY?cDNA最初是從甘薯中克隆出來的(Ishiguro?&?Nakamura,1994),隨后在其他植物如歐芹(Rushton?et?al.,1995)、野燕麥(Rushton?et?al.,1996)、擬南芥(Pater?et?al.,1996)、水稻(孫利軍等,2014)、棗樹(Xue?et?al.,2019)等不同物種中分離鑒定出來。谷彥冰等(2016)利用WRKY保守域全蛋白序列鑒定出61個桃WRKY基因,通過生物信息學分析發(fā)現桃WRKY蛋白分為I、Ⅱ和Ⅲ類型,應用半定量和熒光定量PCR技術發(fā)現有16個WRKY基因均在桃的根、莖、葉、花和果重表達。劉潮等(2017)基于桑樹全基因組蛋白數據庫,鑒定出55個桑樹WRKY基因,通過系統(tǒng)進化分析將WRKY蛋白分為I、Ⅱ和Ⅲ類型,應用保守結構域分析發(fā)現WRKY蛋白序列高度保守,在植物抵御非生物脅迫過程中發(fā)揮作用。包昌艷等(2018)應用“紅陽”獼猴桃全基因組數據,鑒定出89個WRKY基因,通過進化分析發(fā)現WRKY蛋白可分為I、Ⅱ和Ⅲ類型,有33個WRKY基因在獼猴桃根、葉、花和果四個器官中均有顯著表達。Fei?et?al.(2019)從隴南大紅袍花椒中分離鑒定出38個WRKY家族成員,其中ZbWRKY33是對干旱脅迫反應最敏感的成員之一,通過直接與乙烯合成前體基因asc結合調節(jié)花椒抵御干旱的能力。由此可見,諸多植物中WRKY轉錄因子均得到鑒定與分析,但目前針對油棕WRKY轉錄因子基因及蛋白質的鑒定與生物信息學分析的研究鮮見報道,本研究基于油棕基因組數據,利用生物信息學方法全面分析油棕WRKY轉錄因子家族結構及特征,為深入研究WRKY轉錄因子家族的生物學功能奠定基礎。

    1?材料與方法

    1.1?EgWRKY序列獲取與鑒定

    油棕全基因組序列從NCBI下載獲得,擬南芥WRKY基因序列從The?Arabidopsis?Information?Resource(TAIR)數據庫中下載獲得(http://www.arabidopsis.org),以擬南芥WRKY序列為探針,閾值設定為e-10,在油棕基因組數據庫中進行同源序列比對分析得到油棕WRKY基因序列,將得到的油棕WRKY基因序列在美國麻省理工學院在線基因掃描服務器(The?GENSCAN?Web?Server?at?MIT)搜索以獲得WRKY蛋白序列,通過NCBI在線工具CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)和PFAM數據庫(http://pfam.xfam.org/)進行蛋白結構域分析,剔除無WRKY保守結構域的蛋白序列。

    1.2?方法

    1.2.1?EgWRKY蛋白理化性質分析?利用ProtParam分析EgWRKY蛋白的理化性質,利用NetPhos?3.1?Server和DictyOGlyc?1.1?Server預測氨基酸序列磷酸化及O-糖基化修飾情況,利用ProtScale分析蛋白質的親/疏水性,利用SignalP和ProtComp預測蛋白的信號肽和亞細胞定位預測,應用SOPMA預測蛋白的二級結構。

    1.2.2?EgWRKY的進化樹、外顯子及內含子分析

    應用MEGA?6.06軟件構建EgWRKY進化樹,執(zhí)行參數為Neighbor-Joining,Bootstrap重復1?000次。

    2?結果與分析

    2.1?EgWRKY轉錄因子家族成員基本信息

    基于油棕全基因組數據及擬南芥WRKY基因序列,通過BLAST搜索同源序列和WRKY蛋白保守結構域鑒定,共挖掘95個油棕WRKY轉錄因子成員。由表1可知,該95個蛋白質所含氨基酸大小為116~1?303?bp,其中蛋白氨基酸數目小于300?aa的基因序列占35.8%,介于300~700?aa的基因序列占57.9%,大于700?aa的基因序列占6.3%。

    2.2?EgWRKY蛋白理化性質分析

    利用ProtParam在線軟件(http://expasy.org/tools/protparam.html)分析EgWRKY蛋白的基本性質,預測結果如表2所示。95個WRKY蛋白中,56個蛋白的理論等電點(pI)小于7,39個蛋白的pI大于7,pI最小值為4.74(EgWRKY73),最大值為10.18(EgWRKY84),平均pI為7.15;EgWRKY25和EgWRKY56蛋白質的不穩(wěn)定系數小于40,為穩(wěn)定蛋白,其余93個EgWRKY蛋白的不穩(wěn)定系數大于40,為不穩(wěn)定蛋白,該結果表明EgWRKY轉錄因子家族大多為不穩(wěn)定蛋白。利用NetPhos?3.1?Server在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測氨基酸序列磷酸化;利用DictyOGlyc?1.1?Server在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/)預測氨基酸序列的O-糖基化修飾情況,發(fā)現平均磷酸化位點有37.8個,O-糖基化位點有1.6個;利用ProtScale在線軟件(https://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白質的親/疏水性,從EgWRKY蛋白的脂肪系數來看,該95個EgWRKY蛋白的脂肪系數均小于100,該結果表明其均為親水性蛋白;利用SignalP?5.0在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測蛋白的信號肽,發(fā)現5個EgWRKY蛋白存在信號肽(EgWRKY29、EgWRKY38、EgWRKY45、EgWRKY63及EgWRKY87),為分泌蛋白;利用ProtComp?9.0(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)在線軟件預測蛋白亞細胞定位,結果表明95個EgWRKY蛋白中有84個定位在細胞核中,占總蛋白的88.3%,11個在細胞質中,推測可能參與細胞質基因的轉錄調控;應用SOPMA在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/np?sa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測蛋白的二級結構,發(fā)現所有EgWRKY蛋白的二級結構均有4種,即α-螺旋、β-轉角、無規(guī)卷曲及延伸鏈,其中60個EgWRKY蛋白以α-螺旋為主要結構,無規(guī)卷曲為次要結構,35個以無規(guī)卷曲為主要結構,α-螺旋為次要結構,β-轉角及延伸鏈所占比例較少。

    2.3?EgWRKY的進化樹分析

    利用MEGA?6.06對油棕95個WRKY轉錄因子蛋白的保守結構域進行系統(tǒng)進化樹分析,結果如圖1所示。油棕WRKY蛋白主要分為三大類,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類。其中,根據WRKY保守結構域所處的位置,將第I類分為I?N和I?C兩個亞類;第Ⅱ類含有1個鋅指結構和1個WRKY保守結構域,根據鋅指結構的不同,又將其分為Ⅱ?a、Ⅱ?b、Ⅱ?c及Ⅱ?d四個亞類;第Ⅲ類是含有2個WRKY保守結構域。

    2.4?油棕WRKY外顯子及內含子

    通過油棕基因組數據分析得到WRKY轉錄因子基因外顯子和內含子的結構分布示意圖(圖2)。EgWRKY轉錄因子家族成員所含內含子數的范圍為0~12個,平均每個EgWRKY含內含子數為2.99個。其中,EgWRKY42含有內含子數最多(12個),轉錄因子基因長度變化范圍為477?bp(EgWRKY08)至89?167?bp(EgWRKY71),平均大小為5?992?bp,圖2中陰影部分的數字代表該外顯子翻譯成部分WRKY保守結構域的長度。EgWRKY基因家族的結構變化較大,說明在長期進化過程中油棕基因組經歷了較大的變異選擇。

    3?討論與結論

    隨著高通量測序技術的成熟,WRKY作為調控植物多種生理過程的轉錄因子家族之一,已在多個物種中被挖掘及鑒定,如擬南芥基因組中含有72個WRKY轉錄因子(Ulker?&?Somssich,2004),黃瓜基因組中有132個WRKY轉錄因子(谷彥冰等,2015),棉花基因組中有116個WRKY轉錄因子(Dou?et?al.,2014),橡膠樹基因組中含有81個WRKY轉錄因子(Li?et?al.,2014),桑樹基因組中含有54個WRKY轉錄因子(Baranwal?et?al.,2016)及鷹嘴豆基因組中含有70個WRKY轉錄因子(Waqas?et?al.,2019)。本研究通過分析油棕基因組數據,挖掘出95個WRKY轉錄因子,WRKY家族中轉錄因子的數目不僅與物種的基因組相關,而且與植物在長期進化過程中所受的外界環(huán)境影響有關。油棕WRKY轉錄因子數目與其他物種相比,屬于中等數目的類型,該結果可推測油棕在自然進化過程中,WRKY基因家族受到了一定的外界環(huán)境壓力。

    本研究通過預測油棕WRKY蛋白的二級結構,發(fā)現其以α-螺旋及無規(guī)卷曲為主,這與丁蒙蒙等(2018)報道結果相一致。本研究對油棕WRKY保守結構域進行系統(tǒng)進化分析,將油棕WRKY家族蛋白分為三大類,即I、Ⅱ、Ⅲ類,其中Ⅱ類又分為四個亞類。本研究中油棕95個WRKY家族成員均含有WRKYGQK保守基序,Ⅱ類均含有1個鋅指結構及1個WRKY保守結構域,根據鋅指結構和位置的不同又分為四個亞類,類似分類在擬南芥及桑樹等物種中發(fā)現,該結果可推測植物WRKY基因家族在結構上具有高度保守性。油棕作為熱帶地區(qū)重要的油料作物之一,低溫氣候嚴重限制著油棕的大面積種植,若能挖掘與低溫脅迫相關的調節(jié)基因,并對其功能進行預測,運用分子技術對油棕品種進行改良,提高其抗寒性,從而實現油棕大面積的種植。

    參考文獻:

    BAO?CY,DENG?L,ZHOU?J,et?al.,2018.?Genome-wide?identification?and?analysis?of?the?WRKY?transcription?factor?gene?family?in?kiwi?fruit[J].?Mol?Plant?Breed,2(12):301-310.[包昌艷,鄧浪,周軍,等,2018.?獼猴桃WRKY轉錄因子家族全基因組鑒定與分析[J].?分子植物育種,2(12):301-310.]

    BARANWAL?VK,NEGI?N,KHURANA?P,2016.?Genome-wide?identification?and?structural,functional?and?evolutionary?analysis?of?WRKY?components?of?mulberry[J].?Sci?Reports,6:30794-30807.

    DING?MM,SHI?XD,GU?YX,et?al.,2018.?Transcriptome-based?excavation?and?analysis?of?MYB?family?transcription?factors?in?Phoebe?zhennan[J].?Guihaia,38(1):90-100.[丁蒙蒙,時小東,顧雨熹,等,2018.?基于轉錄組的楠木MYB轉錄因子的挖掘及分析[J].?廣西植物,38(1):90-100.]

    DOU?LL,ZHANG?XH,PANG?CY,et?al.,2014.?Genome-wide?analysis?of?the?WRKY?gene?family?in?cotton[J].?Mol?Genet?Genom,289(6):1103-1121.

    FEI?XT,HOU?LX,SHI?JW,et?al,2019.?Patterns?of?drought?response?of?38?WRKY?transcription?factors?of?Zanthoxylum?bungeanum?Maxim[J].?Int?J?Mol?Sci,20(1):68-85.

    GU?YB,JI?ZR,CHI?FM,et?al.,2016.?Genome-wide?identification?and?expression?analysis?of?the?WRKY?gene?family?in?peach[J].?Hereditas,38(3):254-270.[谷彥冰,冀志蕊,遲福梅,等,2016.?桃WRKY基因家族全基因組鑒定和表達分析[J].?遺傳,38(3):254-270.]

    GU?YB,JI?ZR,CHI?FM,et?al.,2015.?Bioinformatics?and?expression?analysis?of?the?WRKY?gene?family?in?apple[J].?Sci?Agric?Sin,48(16):3221-3238.[谷彥冰,冀志蕊,遲福梅,等,2015.?蘋果WRKY基因家族生物信息學及表達分析[J].?中國農業(yè)科學,48(16):3221-3238.]

    ISHIGURO?S,NAKAMURA?K,1994.?Characterization?of?a?cDNA?encoding?a?novel?DNA-binding?protein,SPF1,that?recognizes?SP8?sequences?in?the?5?upstream?regions?of?genes?coding?for?sporamin?and?β-amylase?from?sweet?potato[J].?Mol?Genet?Genet,244(6):563-571.

    JIA?CL,HOU?HS,2010.?Structure?of?plant?WRKY?transcription?factors?and?their?roles?in?plant?defense?response[J].?Tianjin?Agric?Sci,16(2):21-26.[賈翠玲,侯和勝,2010.?植物WRKY轉錄因子的結構特點及其在植物防衛(wèi)反應中的作用[J].?植物生理與生物技術,16(2):21-26.]

    LI?HL,GUO?D,YANG?ZP,et?al.,2014.?Genome-wide?identification?and?characterization?of?WRKY?gene?family?in?Hevea?brasiliensis[J].?Genomics,104(1):14-23.

    LIU?C,HAN?LH,SONG?PB,et?al.,2017.?Genome-wide?identification?and?bioinformatics?analysis?for?mulberry?WRKY?transcription?factors[J].?J?S?Agric,48(9):1691-1699.[劉潮,韓利紅,宋培兵,等,2017.?桑樹WRKY轉錄因子的全基因組鑒定及生物信息學分析[J].?南方農業(yè)學報,48(9):1691-1699.]

    PATER?S,GRECO?V,PHAM?K,et?al.,1996.?Characterization?of?a?zinc?dependent?transcriptional?activator?from?Arabidopsis[J].?Nucl?Acids?Res,24(23):4624-4631.

    RUSHTON?PJ,MACDONALD?H,HUTTLY?AK,et?al.,1995.?Members?of?a?new?family?of?DNA-binding?proteins?bind?to?a?conserved?cis-element?in?the?promoters?of?α-Amy2?genes[J].?Plant?Mol?Biol,29(4):691-702.

    RUSHTON?PJ,TORRES?JT,PARNISKE?M,et?al.,1996.?Interaction?of?elicitor-induced?DNA-binding?proteins?with?elicitor?response?elements?in?the?promoters?of?parsley?PR1?genes[J].?EMBO?J,15?(20):5690-5700.

    SUN?LJ,HUANG?L,LI?DY,et?al.,2014.?Comprehensive?expression?analysis?suggests?overlapping?of?rice?OsWRKY?transcription?factor?genes?during?abiotic?stress?responses[J].?Plant?Physiol?J,50(11):1651-1658.[孫利軍,黃磊,李大勇,等,2014.?水稻OsWRKY轉錄因子對非生物脅迫響應的重疊表達特性分析[J].?植物生理學報,50(11):1651-1658.]

    ULKER?B,SOMSSICH?IE,2004.?WRKY?transcription?factors:From?DNA?binding?towards?biological?function[J].?Curr?Opin?Plant?Biol,7(5):491-498.

    WAQAS?M,AZHAR?MT,RANA?IA,et?al.,2019.?Genome-wide?identification?and?expression?analyses?of?WRKY?transcription?factor?family?members?from?chickpea?(Cicer?arietinum?L.)?reveal?their?role?in?abiotic?stress-responses[J].?Genes?Genom,41(4):467-481.

    WU?LT,DU?CF,ZHANG?MQ,et?al.,2013.?The?structure?and?function?of?WRKY?transcription?factors?in?abiotic?and?biotic?stress[J].?Mol?Plant?Breed,11(4):634-638.[伍林濤,杜才富,張敏琴,等,2013.?WRKY轉錄因子的結構及其在植物抗逆境脅迫中的功能[J].?分子植物育種,11(4):634-638.]

    XIE?ZW,WANG?LJ,CHEN?JY,et?al.,2016.?Studies?on?WRKY?transcription?factors?and?their?biological?functions?in?plants[J].?J?Agric?Sci?Technol,18(3):46-54.[謝政文,王連軍,陳錦洋,等,2016.?植物WRKY轉錄因子及其生物學功能研究進展[J].?中國農業(yè)科技導報,18(3):46-54.]

    XUE?CL,LI?HT,LIU?ZG,et?al.,2019.?Genome-wide?analysis?of?the?WRKY?gene?family?and?their?positive?responses?to?phytoplasma?invasion?in?Chinese?jujube[J].?BMC?Genom,20(1):?464-478.

    (責任編輯?周翠鳴)

    猜你喜歡
    油棕表達分析生物信息學
    棕櫚栽培管理初探
    “PBL+E—learning”教學模式探索
    移動教學在生物信息學課程改革中的應用
    今傳媒(2016年11期)2016-12-19 11:35:50
    中醫(yī)大數據下生物信息學的發(fā)展及教育模式淺析
    數據挖掘技術在生物信息學中的應用
    紅花生育酚環(huán)化酶基因的克隆及表達分析
    玉米紋枯病病菌y—谷氨酰轉肽酶基因克隆與表達分析
    信號分子與葉銹菌誘導下小麥病程相關蛋白1基因的表達分析
    水稻OsCATA基因相互作用蛋白的篩選和表達分析
    泰國油棕果市價連跌2個月
    欧美日韩视频高清一区二区三区二| 午夜精品国产一区二区电影| 美女中出高潮动态图| 美女高潮到喷水免费观看| 国产成人精品无人区| 免费观看a级毛片全部| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日日夜夜操网爽| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲图色成人| 亚洲久久久国产精品| 国产高清不卡午夜福利| 精品国产一区二区久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 美国免费a级毛片| 欧美日韩黄片免| av在线老鸭窝| 亚洲,欧美,日韩| 视频区欧美日本亚洲| 岛国毛片在线播放| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美国产精品va在线观看不卡| av电影中文网址| 亚洲色图综合在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 国产高清videossex| 高潮久久久久久久久久久不卡| 美国免费a级毛片| 久久 成人 亚洲| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲精品日本国产第一区| 天堂俺去俺来也www色官网| 老司机靠b影院| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美日韩亚洲高清精品| tube8黄色片| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲精品一二三| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产欧美亚洲国产| 国产熟女欧美一区二区| 男的添女的下面高潮视频| 日韩大码丰满熟妇| 午夜老司机福利片| 婷婷丁香在线五月| 制服人妻中文乱码| 在线观看免费高清a一片| 老司机影院成人| 亚洲五月色婷婷综合| 黄色 视频免费看| 国产野战对白在线观看| 国产一卡二卡三卡精品| 只有这里有精品99| 人人澡人人妻人| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 蜜桃在线观看..| 伊人亚洲综合成人网| xxx大片免费视频| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲成人免费av在线播放| 岛国毛片在线播放| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲国产精品一区三区| 黄色 视频免费看| 91精品三级在线观看| 久久99精品国语久久久| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲精品美女久久av网站| 超色免费av| 多毛熟女@视频| 女性被躁到高潮视频| 亚洲精品一区蜜桃| 国产有黄有色有爽视频| 大码成人一级视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 亚洲,欧美精品.| 精品福利永久在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 性色av一级| 亚洲精品一二三| 国产成人影院久久av| 国产视频首页在线观看| 久久久精品区二区三区| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品一国产av| 真人做人爱边吃奶动态| 18禁观看日本| 99国产综合亚洲精品| bbb黄色大片| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 妹子高潮喷水视频| 两个人免费观看高清视频| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美日韩综合久久久久久| www.熟女人妻精品国产| 热re99久久国产66热| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 高清视频免费观看一区二区| 免费高清在线观看日韩| 久久99精品国语久久久| 一区在线观看完整版| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日本一区二区免费在线视频| 中文字幕色久视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 青春草亚洲视频在线观看| 婷婷色综合www| 一级黄片播放器| 新久久久久国产一级毛片| 18禁国产床啪视频网站| 久久中文字幕一级| 青草久久国产| 久久久久视频综合| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 高清欧美精品videossex| 五月天丁香电影| 热re99久久国产66热| www.自偷自拍.com| 交换朋友夫妻互换小说| 一级毛片电影观看| 蜜桃国产av成人99| 成在线人永久免费视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 超碰成人久久| 日韩视频在线欧美| 国产黄色免费在线视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美xxⅹ黑人| 国产精品一区二区免费欧美 | 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 欧美成人午夜精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产精品一国产av| 最近手机中文字幕大全| 国产精品久久久av美女十八| 最新的欧美精品一区二区| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产一级毛片在线| 久久国产精品大桥未久av| 午夜激情久久久久久久| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲精品国产av成人精品| 久久亚洲精品不卡| bbb黄色大片| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日韩电影二区| 香蕉国产在线看| 看免费av毛片| 天天影视国产精品| 久久精品亚洲av国产电影网| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产在线观看jvid| 欧美日韩成人在线一区二区| 日韩免费高清中文字幕av| 日韩电影二区| 国产精品一国产av| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 免费在线观看完整版高清| 日本av免费视频播放| 国产免费一区二区三区四区乱码| 美女中出高潮动态图| 日韩大码丰满熟妇| 婷婷色综合www| 亚洲国产看品久久| 女警被强在线播放| 亚洲三区欧美一区| 香蕉丝袜av| 亚洲欧洲日产国产| 成年av动漫网址| 国产亚洲精品久久久久5区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 永久免费av网站大全| 青春草亚洲视频在线观看| 老司机靠b影院| 成年美女黄网站色视频大全免费| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 午夜免费成人在线视频| 国产精品国产三级专区第一集| 男男h啪啪无遮挡| 久久狼人影院| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲国产精品999| 国产极品粉嫩免费观看在线| 97人妻天天添夜夜摸| 欧美日本中文国产一区发布| 精品久久蜜臀av无| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美xxⅹ黑人| 午夜日韩欧美国产| 亚洲男人天堂网一区| 日韩大片免费观看网站| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 中国美女看黄片| av在线播放精品| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 两性夫妻黄色片| 亚洲成人手机| 亚洲,欧美,日韩| 狂野欧美激情性xxxx| 激情视频va一区二区三区| 成在线人永久免费视频| xxxhd国产人妻xxx| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产成人系列免费观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日本黄色日本黄色录像| 男女国产视频网站| 日韩视频在线欧美| 亚洲免费av在线视频| 久久精品久久久久久久性| 久久女婷五月综合色啪小说| 人人澡人人妻人| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲av成人精品一二三区| 老司机在亚洲福利影院| 国产精品av久久久久免费| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲第一av免费看| 99香蕉大伊视频| 国产精品熟女久久久久浪| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 各种免费的搞黄视频| 欧美日韩黄片免| 人成视频在线观看免费观看| 国产1区2区3区精品| 精品视频人人做人人爽| av福利片在线| 天堂俺去俺来也www色官网| 男女之事视频高清在线观看 | 国产又色又爽无遮挡免| 各种免费的搞黄视频| 亚洲精品国产区一区二| 国产成人影院久久av| 美国免费a级毛片| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 日韩大片免费观看网站| 精品福利观看| 一二三四社区在线视频社区8| 女警被强在线播放| 老司机深夜福利视频在线观看 | 国产精品成人在线| 国产精品免费视频内射| 国产有黄有色有爽视频| 黄色a级毛片大全视频| 免费少妇av软件| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲精品日本国产第一区| 国产欧美亚洲国产| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 搡老岳熟女国产| av福利片在线| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产伦理片在线播放av一区| 国产精品 欧美亚洲| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲成人免费电影在线观看 | 婷婷丁香在线五月| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久性视频一级片| 少妇 在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 欧美日韩福利视频一区二区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 男女之事视频高清在线观看 | 99re6热这里在线精品视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| av天堂在线播放| 国产精品一国产av| 久久久久久免费高清国产稀缺| 满18在线观看网站| 老司机亚洲免费影院| 午夜福利在线免费观看网站| 热re99久久国产66热| 亚洲,欧美,日韩| 男女高潮啪啪啪动态图| 两个人免费观看高清视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 水蜜桃什么品种好| 男女免费视频国产| 高清欧美精品videossex| 久久久国产精品麻豆| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品国产av在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 嫁个100分男人电影在线观看 | 日本色播在线视频| 久久精品久久久久久久性| 国产精品 国内视频| 一区二区三区乱码不卡18| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 制服人妻中文乱码| 国产又色又爽无遮挡免| 国产高清videossex| 美女中出高潮动态图| 日韩大片免费观看网站| av在线老鸭窝| 精品久久蜜臀av无| 日韩视频在线欧美| 日韩av免费高清视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产深夜福利视频在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 老司机靠b影院| 国产黄频视频在线观看| 妹子高潮喷水视频| 欧美日韩视频精品一区| 免费看av在线观看网站| 后天国语完整版免费观看| 99热全是精品| 欧美日韩成人在线一区二区| 激情视频va一区二区三区| 亚洲av国产av综合av卡| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美xxⅹ黑人| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲图色成人| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 中文字幕制服av| 香蕉国产在线看| 国产亚洲一区二区精品| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲av综合色区一区| 久久精品成人免费网站| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久久久国产精品人妻一区二区| 日韩人妻精品一区2区三区| 不卡av一区二区三区| 亚洲九九香蕉| 老司机深夜福利视频在线观看 | 大码成人一级视频| 男女无遮挡免费网站观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 男女午夜视频在线观看| 成人国产av品久久久| 欧美国产精品va在线观看不卡| 叶爱在线成人免费视频播放| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 最近最新中文字幕大全免费视频 | 欧美日韩成人在线一区二区| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美日韩视频精品一区| 999久久久国产精品视频| av福利片在线| 国产在线一区二区三区精| 日本午夜av视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产色视频综合| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 1024视频免费在线观看| 亚洲三区欧美一区| 久9热在线精品视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 女警被强在线播放| 男女午夜视频在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产激情久久老熟女| 美女午夜性视频免费| 精品久久蜜臀av无| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 高清av免费在线| 日韩电影二区| 制服人妻中文乱码| 欧美日本中文国产一区发布| 大片免费播放器 马上看| 久久国产精品大桥未久av| 精品久久久精品久久久| 亚洲一码二码三码区别大吗| 九色亚洲精品在线播放| 国产成人影院久久av| 在线观看www视频免费| 久久九九热精品免费| 性色av一级| 一区在线观看完整版| 黄色 视频免费看| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久人人97超碰香蕉20202| 极品人妻少妇av视频| 丝袜喷水一区| www.精华液| 久久天堂一区二区三区四区| 91老司机精品| 女人久久www免费人成看片| 99久久99久久久精品蜜桃| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 老司机影院成人| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久国产精品影院| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产一级毛片在线| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产日韩欧美在线精品| 国产高清videossex| 亚洲av美国av| 中文字幕av电影在线播放| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| netflix在线观看网站| 免费观看av网站的网址| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 丝袜人妻中文字幕| 欧美亚洲日本最大视频资源| 老司机午夜十八禁免费视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲国产中文字幕在线视频| a级片在线免费高清观看视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 90打野战视频偷拍视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 欧美精品一区二区大全| 一区二区三区激情视频| 日本午夜av视频| 99久久人妻综合| 十分钟在线观看高清视频www| 美女午夜性视频免费| 国产高清videossex| 精品少妇黑人巨大在线播放| 丰满少妇做爰视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲国产av新网站| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产高清videossex| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲成人手机| 天天操日日干夜夜撸| 秋霞在线观看毛片| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 成年av动漫网址| 少妇的丰满在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 久久综合国产亚洲精品| 老司机影院毛片| 亚洲一区中文字幕在线| 香蕉国产在线看| 久久中文字幕一级| 欧美精品亚洲一区二区| 国产一区二区三区av在线| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 手机成人av网站| 只有这里有精品99| 99久久人妻综合| 大片电影免费在线观看免费| 男女床上黄色一级片免费看| 91九色精品人成在线观看| 满18在线观看网站| 妹子高潮喷水视频| 国产97色在线日韩免费| 国产精品国产av在线观看| av在线播放精品| 亚洲欧洲日产国产| 99国产精品免费福利视频| 久久99热这里只频精品6学生| 国产成人精品在线电影| a 毛片基地| 午夜av观看不卡| 国产野战对白在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| av有码第一页| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 啦啦啦在线观看免费高清www| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 91精品伊人久久大香线蕉| 满18在线观看网站| 国产一级毛片在线| 狂野欧美激情性xxxx| 国产一卡二卡三卡精品| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲黑人精品在线| 久久久久久久大尺度免费视频| 日韩中文字幕视频在线看片| 人妻一区二区av| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久久久久久国产电影| 日韩av免费高清视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 一本久久精品| 18在线观看网站| 亚洲图色成人| 激情五月婷婷亚洲| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 女性被躁到高潮视频| 国产一区二区三区av在线| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美大码av| 天天添夜夜摸| 日韩一区二区三区影片| 操美女的视频在线观看| 国产一卡二卡三卡精品| 91九色精品人成在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| av线在线观看网站| √禁漫天堂资源中文www| 国产三级黄色录像| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 麻豆国产av国片精品| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 香蕉丝袜av| 国产精品一二三区在线看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美黑人精品巨大| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久久久久久大尺度免费视频| 一级片'在线观看视频| 91精品三级在线观看| av不卡在线播放| 亚洲天堂av无毛| 欧美在线黄色| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产伦人伦偷精品视频| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲国产欧美在线一区| www.999成人在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲国产看品久久| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 黑丝袜美女国产一区| 亚洲精品第二区| 99热网站在线观看| 宅男免费午夜| 婷婷色综合www| 欧美日韩视频精品一区| 日韩电影二区| 国产成人精品久久二区二区免费| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精品一区二区三区av网在线观看 | avwww免费| 美女福利国产在线| 亚洲激情五月婷婷啪啪| av在线app专区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久中文字幕一级| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 在线观看免费午夜福利视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 在线观看免费高清a一片| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲成人免费av在线播放| 黄色a级毛片大全视频| 满18在线观看网站| 成人国产一区最新在线观看 | 国产精品一区二区在线观看99| 国产视频一区二区在线看| 桃花免费在线播放| 十八禁网站网址无遮挡| 欧美日韩精品网址| 国产成人91sexporn| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲一区中文字幕在线| 日本wwww免费看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美国产精品va在线观看不卡| 日韩伦理黄色片| 热99久久久久精品小说推荐| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 嫁个100分男人电影在线观看 | 我的亚洲天堂| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 免费看av在线观看网站| 午夜久久久在线观看| 色网站视频免费| 美女视频免费永久观看网站| svipshipincom国产片| 久久国产精品大桥未久av| 免费看av在线观看网站| 午夜久久久在线观看| 国产av精品麻豆| 国产成人欧美| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 波野结衣二区三区在线| 国产精品一二三区在线看| av网站在线播放免费| 亚洲人成77777在线视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 2018国产大陆天天弄谢| 成在线人永久免费视频| 老司机靠b影院| 精品一区在线观看国产| 天堂中文最新版在线下载| 久久人人97超碰香蕉20202| 精品第一国产精品| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲一区二区三区欧美精品|