北美鵝掌楸CPP轉(zhuǎn)錄因子家族LtTCX2基因的克隆與分析

劉換換 楊立春 張成閣 郝自遠(yuǎn) 李火根

摘?要：CPP（cystein-richpolycomb-likeproteinor?Tesmin/TOS1-like）家族屬于成員數(shù)目較少的一類轉(zhuǎn)錄因子基因家族，含有保守的富含Cystein的CRC結(jié)構(gòu)域，在植物發(fā)育進程中，主要參與花發(fā)育、細(xì)胞分裂、分子進化等。為了探索CPP轉(zhuǎn)錄因子家族在北美鵝掌楸花發(fā)育中的作用，該文以北美鵝掌楸（Liriodendron?tulipifera）為材料，采用RACE技術(shù)克隆出1個CPP-like家族基因，命名為LtTCX2，全長2?866?bp。通過NCBI網(wǎng)站在線分析，ORF長2?424?bp，編碼了807個氨基酸，含2個保守的TSO1-like?CXC結(jié)構(gòu)域，分子量為88?699.25?Da，理論等電點為5.83，不穩(wěn)定系數(shù)為62.38，疏水性平均值為-0.619，預(yù)測為親水性蛋白、非跨膜蛋白、核蛋白，不含信號肽及切割位點。氨基酸比對及系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，LtTCX2與其他物種的CPP家族TCX蛋白具有較高的同源性，與亞洲蓮（Nelumbo?nucifera）的NnTCX2、胡楊（Populus?euphratica）的PeTCX2進化關(guān)系最近。熒光定量PCR結(jié)果顯示，LtTCX2基因在葉片中表達量最高，在萼片、花瓣中幾乎不表達，表達量由高至低如下：葉片、花芽、雌蕊、雄蕊、莖、根、花瓣、萼片。以上結(jié)果說明，LtTCX2屬于較古老、保守的一類基因，可為從分子生物學(xué)層面研究鵝掌楸屬植物系統(tǒng)進化提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：北美鵝掌楸，CPP-like家族，LtTCX2基因，CRC結(jié)構(gòu)域，組織特異性表達

中圖分類號：Q943

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）07-0998-12

Abstract：CPP?（Cystein-rich?polycomb-like?protein?or?Tesmin/TOS1-like）?protein?family?are?one?kind?of?transcription?factors?with?fewer?members?and?possess?a?conserved，Cys-rich?CRC?domains.?CPP?transcription?factor?family?plays?an?important?role?in?the?plant?development?of?reproductive?tissue?and?cell?division.?In?this?study，a?CPP-like?family?gene?was?cloned?by?RACE?methods?from?Liriodendron?tulipifera?named?LtTCX2?to?explore?the?function?in?regulating?flower?development.?The?full?length?of?LtTCX2?was?2?866?bp.?LtTCX2?contained?an?open?reading?frame?（ORF）?of?2?424?bp，encoding?807?amino?acids?with?two?conserved?TSO1-like?CXC?domains?by?bioinformatics?analysis?on?NCBI?site.?The?molecular?weight?of?protein?was?88?699.25?Da，isoelectric?point?was?5.83?and?coefficient?of?instability?was?62.38.?LtTCX2?was?predicted?to?be?hydrophilic?and?non-transmembrane?nucleoprotein?without?signal?peptide.?The?amino?acid?homology?sequence?and?phylogenetic?analysis?demonstrated?that?LtTCX2?had?high?homology?with?other?CPP-like?family?proteins?and?was?most?closely?related?with?NnTCX2?in?Nelumbo?nucifera?and?PeTCX2?in?Populus?euphratica.?Real-time?quantitative?PCR?showed?that?LtTCX2?gene?was?highly?expressed?in?the?leaf?and?hardly?expressed?in?the?sepal?and?petal.?The?tissue?specific?expression?order?from?high?to?low?was?that?the?leaf，flower?bud，pistil，stamen，stem，root，petal?and?sepal.?These?results?suggested?that?LtTCX2?is?a?rather?conservative?gene?and?provide?several?help?to?the?phylogenetic?evolution?of?Liriodendron?plants?from?the?molecular?biology?level.

Key?words：Liriodendron?tulipifera，CPP-like?family，LtTCX2?gene，CRC?domain，tissue?specific?expression

CPP-like蛋白是一類廣布于生物中、成員較少的轉(zhuǎn)錄因子，目前未在酵母中發(fā)現(xiàn)。CPP家族基因具有1～2個高度保守、富含半胱氨酸Cys的CXC結(jié)構(gòu)域C1和C2（pfam036308，CXCX4CX3YCX-CX6CX3CXCX2C），以及連接二者、長度可變的保守的R序列（RNPXAFXPK），3段保守序列即構(gòu)成保守的?CRC結(jié)構(gòu)域（C1-RNPXAFXPK-C2）（Song?et?al.，2000;Andersen?et?al.，2007）。CPP家族基因主要集中于動物方面的調(diào)控研究，在植物中的功能研究較少（閔浩巍，2013），在植物中主要參與細(xì)胞分化、繁殖器官發(fā)育。Liu?et?al.（1997）首次在擬南芥（Arabidopsis?thaliana）中獲得的CPP-like家族基因是TSO1。TSO1是一種核蛋白，在花器官中高度表達，調(diào)控細(xì)胞分裂與細(xì)胞膨大（Hauser?et?al.，1998）。通過對tso1突變體的研究，該基因?qū)?xì)胞的方向性增長發(fā)揮作用，并影響到有絲分裂和胞質(zhì)分裂，說明TSO1基因?qū)M南芥花器官的形成是必需的，推測其可能是編碼花器官細(xì)胞分裂的重要元件（Liu?et?al.，1997;Hauser?et?al.，1998，2000）。隨后，在大豆（Glycine?max）中發(fā)現(xiàn)了1個CPP1蛋白，發(fā)現(xiàn)其參與共生根瘤中l(wèi)eghemoglobin基因調(diào)控（Cvitanich?et?al.，2000）。目前已陸續(xù)在大豆、水稻（Oryza?sativa）、小麥（Triticum?aestivum）、玉米（Zea?mays）等植物中發(fā)現(xiàn)CPP-like家族基因，并對它們的功能進行了一些探索（Yang?et?al.，2008;?王凱，2010;孟超敏等，2014;Zhang?et?al.，2015;Song?et?al.，2016;潘冉冉等，2018）。水稻和擬南芥CPP-like家族都具有高度保守的CRC結(jié)構(gòu)域，單子葉和雙子葉植物分化之前，CPP-like家族基因發(fā)生過大幅度的擴張，分化完成后，二者的CPP-like家族基因按照物種特異性的方式進行了擴張，擬南芥存在基因丟失現(xiàn)象，而兩段CXC結(jié)構(gòu)域及R序列則是協(xié)同進化（Yang?et?al.，2008;王凱，2010）。目前，對CPP轉(zhuǎn)錄因子在單子葉和真雙子葉植物中的少數(shù)模式植物中進行了初步的進化分析，對該家族在基部被子植物中的進化過程尚待探索與研究。

鵝掌楸屬（Liriodendron）隸屬于木蘭科（Magnoliaceae），是第四紀(jì)冰川作用后的孑遺植物，自然散落分布。鵝掌楸屬植物是基部被子植物系的典型植物，在植物進化發(fā)生系統(tǒng)中具有特殊地位，且保存了許多花部器官原始特征，是研究開花植物進化進程的理想樹種（Ronse?et?al.，2003;Zahn?et?al.，2005）。鵝掌楸屬主要包括兩個種，鵝掌楸（L.?chinense）和北美鵝掌楸（L.?tulipifera）（Parks?et?al.，1983）。北美鵝掌楸和鵝掌楸有著相似的外形，但要比鵝掌楸高大，花色豐富，花型優(yōu)美，且屬于典型的蜜源植物，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟效益，是北美地區(qū)最大且觀賞性優(yōu)良的樹種之一（Beck，1990）。北美鵝掌楸相比于其他樹種，不需要精細(xì)的管理，很少受到病蟲害的侵害，對金屬毒害也有一定的防御功能，是優(yōu)良的園林綠化樹種（Klugh?et?al.，2003）。本文選擇基部被子植物中的北美鵝掌楸為材料，采用RACE法克隆出CPP-like家族LtTCX2基因，并對其組織特異性表達和生物信息學(xué)進行分析，以期為后人研究北美鵝掌楸CPP-like家族基因、花的發(fā)育調(diào)控提供一定的研究理論基礎(chǔ);結(jié)合LtTCX2基因的系統(tǒng)進化分析，初步探索該基因在植物中的理論進化過程，以期為鵝掌楸屬植物在被子植物中的地位提供分析生物學(xué)層面的新思路及依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

材料：北美鵝掌楸選自位于江蘇省鎮(zhèn)江市句容下蜀的南京林業(yè)大學(xué)實習(xí)林場基地鵝掌楸屬種源試驗林，均為成年，樹齡為27?a。試驗林營建于1993年，地理位置為119°14′E、31°59′N。采集北美鵝掌楸新鮮的花芽、根、莖、葉、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊，做好標(biāo)記，迅速置于液氮中，帶回實驗室，存于-80?℃超低溫冰箱中保存。

試劑：多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）購自天根生化科技（北京）有限公司;巰基乙醇購自上海捷瑞生物工程有限公司;pEASY-Blunt?Cloning?Kit克隆載體試劑盒、EasyPure?Quick?Gel?Extraction?Kit切膠回收試劑盒、大腸桿菌菌株Trans1-T1?phage?resistant?chemically?competent?cell感受態(tài)、X-gal、核酸染料Gel?Stain均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;PrimeScriptTM?RT?Master?Mix?（Perfect?Real?Time）、SMARTer?RACE5′/3′?Kit和3′-Full?RACE?Core?Set?with?PrimeScrip?RTase?Kit均購自TAKARA公司;DNA?Marker、Green?Taq?Mix、Phanta?Max?Super-Fridelity?DNA?Polymerase均購自南京諾唯贊生物科技有限公司;瓊脂糖Agarose購自北京擎科生物技術(shù)公司;無水乙醇等其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2?北美鵝掌楸組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

北美鵝掌楸根、莖、葉等組織的總RNA提取主要按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）說明書進行，所得產(chǎn)物于-80?℃超低溫冰箱中保存。RNA完整性使用1%凝膠電泳檢測，若28S和18S?rRNA兩條帶亮度為1.5～2倍，無彌散片狀、條帶消失，則說明RNA完整性較好。RNA濃度檢測使用微量分光光度計（NANODROP?2000，ThermoFisher公司），若OD260/280、OD260/230比值處于1.8～2.1之間，說明RNA質(zhì)量較好。反轉(zhuǎn)錄采用10?μL體系，反轉(zhuǎn)錄酶5×PrimerScript?RT?Master?Mix加入2?μL，RNA使用500?ng，ddH2O補足10?μL，輕柔混勻。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37?℃反應(yīng)15?min，85?℃反轉(zhuǎn)錄酶失活5?s，4?℃終止反應(yīng)，所得即為cDNA第一條鏈，用作克隆目的基因中間片段的模板，-20?℃保存?zhèn)溆谩?′RACE、5′RACE所使用的cDNA分別參照3′-Full?RACE?Core?Set?with?PrimeScrip?RTase?Kit、SMARTer?RACE5′/3′?Kit說明書進行。

1.3?引物合成與測序

所用引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，測序由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成。

1.4?北美鵝掌楸LtTCX2基因全長克隆

在本實驗室的北美鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫中根據(jù)NR功能注釋，挑選一條CPP-like家族TSO1-like的unigene，基因ID為c108078.graph_c0，共3?174?bp。使用Oligo7設(shè)計中間片段引物，以cDNA為模板，高保真酶為Phanta?Max?Super-Fridelity?DNA?Polymerase，配制50?μL體系的反應(yīng)液。PCR反應(yīng)程序：95?℃預(yù)變性3?min，95?℃變性15?s，退火15?s，72?℃延伸60?s/kb，35個循環(huán)，72?℃徹底延伸5?min，4?℃終止反應(yīng)。使用1.5%瓊脂凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，120?V電壓電泳40?min，于凝膠成像儀中拍照并切下含有目的片段的凝膠，參照EasyPure?Quick?Gel?Extraction?Kit說明書進行目的片段回收。將目的片段連接到pEASY-Blunt載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂在加入抗生素的LB平板上，37?℃過夜培養(yǎng)，進行藍白斑篩選，對8個菌落進行PCR檢測，使用M13通用引物，挑選3個片段大小正確的陽性菌落送至公司測序。獲得正確的中間片段后，設(shè)計3′RACE、5′RACE引物，采用巢式PCR擴增，反應(yīng)體系、PCR條件、連接轉(zhuǎn)化、菌落檢測與中間片段擴增相同。將中間片段、3′RACE、5′RACE所得序列使用BioXM?2.6軟件進行拼接，獲得基因全長，將全長序列于NCBI數(shù)據(jù)庫中的ORF?Finder網(wǎng)站進行在線預(yù)測ORF，在起始密碼子和終止密碼子附近設(shè)計引物，驗證ORF的準(zhǔn)確性，將完整的ORF于NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST?Protein進行在線功能比對，結(jié)合比對結(jié)果、其他物種的序列以及保守結(jié)構(gòu)域，對目的基因進行命名。LtTCX2基因全長克隆實驗中所用引物見表1。

1.5?生物信息學(xué)分析

將基因全長放入ORF?Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線分析預(yù)測開放閱讀框ORF，確定基因編碼蛋白序列;通過ExPASy?ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線分析蛋白質(zhì)氨基酸組成、含量、分子量、等電點等特性;通過ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）在線軟件分析蛋白疏水性分析;通過ExPASy?TMpred（https：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）和TMHMM（https：//www.cbs.edu.dk/services/TMHMM-2.0）在線分析蛋白跨膜區(qū)、擴膜方向;通過SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在線預(yù)測分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu);通過在線軟件SignalP-4.0?Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）預(yù)測蛋白的信號肽;通過TargetP1.1?Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）和WoLF?PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在線軟件預(yù)測蛋白亞細(xì)胞定位;通過Motif?Scan（https：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）在線分析該蛋白的結(jié)構(gòu)域;將蛋白序列與NCBI網(wǎng)站進行BLAST?Protein比對，選擇與之同源性較高的蛋白序列，通過DNAMAN軟件，進行蛋白同源性比對分析;于NCBI上搜索其他物種的同源序列，使用MEGA7軟件構(gòu)建進化樹（Kumar?et?al.，2004）。

1.6?實時熒光定量PCR分析

以花芽、根、莖、葉、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊的RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，本實驗室篩選出較穩(wěn)定的LcActin97為內(nèi)參引物，LtTCX2基因引物見表2，進行半定量PCR反應(yīng)（Tu?et?al.，2019）。熒光定量PCR反應(yīng)為10?μL體系，cDNA共50?ng，使用ABI熱循環(huán)儀，反應(yīng)程序：95?℃預(yù)變性1?min，95?℃變性5～10?s，60?℃延伸30～34?s，40個循環(huán)，1個溶解曲線95?℃?15?s，60?℃?1?min，95?℃?15?s。反應(yīng)結(jié)果后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)出，參照2-ΔΔCT法計算該基因的相對表達量，使用ORIGIN軟件繪制基因表達圖。

2?結(jié)果與分析

2.1?北美鵝掌楸組織總RNA提取

將北美鵝掌楸花芽、根、葉、莖、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊共8個組織的總RNA按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）提取RNA。通過1%凝膠電泳檢測RNA完整性，發(fā)現(xiàn)28S和18S?rRNA兩條帶亮度為1.5～2倍，無明顯彌散片狀、條帶消失現(xiàn)象，且OD260/280、OD260/230比值處于1.8～2.1之間，說明RNA質(zhì)量、完整性較好（圖1）。

2.2?北美鵝掌楸LtTCX2基因克隆

從北美鵝掌楸轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫中篩選1個CPP-like家族unigene，總長度3?174?bp，通過設(shè)計引物依次進行中間片段擴增、3′RACE擴增、5′RACE擴增，回收產(chǎn)物進行連接轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆送至公司測序，拼接出目的基因的完整序列。鑒于LtTCX2基因片段過長，將其中間片段分為兩部分依次擴增。通過NCBI網(wǎng)站進行ORF驗證，設(shè)計引物驗證ORF序列的準(zhǔn)確性（圖2）。最終，LtTCX2基因全長2?866?bp，ORF為2?424?bp，編碼了807個氨基酸，5′UTR長228?bp，3′UTR長214?bp。

2.3?北美鵝掌楸LtTCX2基因生物信息學(xué)分析

2.3.1?蛋白理化性質(zhì)及跨膜區(qū)預(yù)測分析?將LtTCX2基因序列放入NCBI在線軟件進行ORF預(yù)測，確定基因編碼的蛋白序列。結(jié)果顯示，LtTCX2基因的ORF長2?424?bp，編碼了807個氨基酸，以ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子。通過Motif?Scan在線分析LtTCX2蛋白的結(jié)構(gòu)域，含有2個TSO1-like?CXC結(jié)構(gòu)域，分別位于504～545、590～631?aa（圖3）。

將ORF編碼的蛋白序列通過ExPASy?ProtParam?在線分析氨基酸組成、含量、分子量等。LtTCX2蛋白總分子式為C3819H6084N1096O1256S39，分子量為88?699.25?Da，由807個氨基酸殘基組成，理論等電點為5.83，帶正電荷（Arg?+?Lys）的氨基酸殘基數(shù)為100個，帶負(fù)電荷（Asp?+?Glu）的氨基酸殘基數(shù)為115個。蛋白質(zhì)分子氨基酸組成中絲氨酸（Ser）含量最高，共96個，占11.9%，其次為谷氨酸（Glu，65個，8.1%），色氨酸（Trp，1個，0.1%）含量最低。該蛋白在哺乳動物體外網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30?h，在酵母中半衰期大于20?h，在大腸桿菌中半衰期大于10?h。不穩(wěn)定系數(shù)為62.38，脂溶性指數(shù)為65.37，疏水性平均值為-0.619。通過ProtScale在線軟件進行蛋白疏水性分析，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)氨基酸殘基，縱坐標(biāo)為該位點氨基酸殘基疏水性值，正值表示疏水性氨基酸，負(fù)值表示親水性氨基酸。LtTCX2蛋白含有疏水區(qū)域和親水區(qū)域，疏水性平均值為-0.619，為親水性蛋白（圖4：A）。

通過ExPASy?TMpred和TMHMM在線軟件預(yù)測分析蛋白跨膜區(qū)、擴膜方向。TMpred表明，LtTCX2蛋白僅在第39～58?aa處具有一個跨膜螺旋，TMHMM結(jié)果進一步表明LtTCX2為非跨膜蛋白（圖4：B，C）。

2.3.2?蛋白二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測?通過SOPMA在線預(yù)測分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)。LtTCX2蛋白具有4種二級結(jié)構(gòu)，無規(guī)則卷曲（Cc）占70.63%，α螺旋（Hh）占20.32%，延伸鏈（Ee）占6.94%，β轉(zhuǎn)角占2.11%（圖5：A）。通過SWISS-MODEL網(wǎng)站使用同源建模法在線預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)（圖5：B）。

2.3.3?信號肽預(yù)測與亞細(xì)胞定位?通過SignalP-4.0?Server在線軟件預(yù)測蛋白的信號肽，結(jié)果表明，LtTCX2蛋白不含信號肽及切割位點（圖6）。蛋白亞細(xì)胞定位通過兩種不同方法預(yù)測，即TargetP1.1?Server和WoLF?PSORT在線軟件，結(jié)合兩個結(jié)果，預(yù)測該蛋白主要定位于細(xì)胞核，應(yīng)為核蛋白（表2，表3）。

2.3.4?氨基酸同源性分析?將LtTCX2氨基酸序列放入NCBI中BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)，LtTCX2氨基酸與其他物種的CPP-like家族蛋白具有較高的同源性，大多具有保守的CRC結(jié)構(gòu)域。選擇與LtTCX2同源性較高的15個蛋白序列，通過DNAMAN軟件，進行氨基酸同源性比對分析。15個蛋白分別為沉水樟（Cinnamomum?micranthum?f.?kanehirae，RWR88930.1）、?亞洲蓮（Nelumbo?nucifera，XP_010259114.1，XP_010256140.1）、葡萄（Vitis?vinifera，XP_010649949.1，XP_010649950.1）、可可（Theobroma?cacao，XP_007034831.2）、博落回（Macleaya?cordata，OVA15531.1）、歐洲甜櫻桃（Prunus?avium，XP_021828183.1）、土瓶草（Cephalotus?follicularis，GAV57585.1）、桃（Prunus?persica，XP_020410865.1）、胡桃（Juglans?regia，XP_018839385.1）、毛果楊（Populus?trichocarpa，XP_024462660.1）、胡楊（P.?euphratica）、銀白楊（P.?alba，TKR83702.1）、海棗（Phoenix?dactylifera，XP_008789994.1）。結(jié)果表明16個蛋白序列同源性達66.28%，CPP-like家族蛋白具有較高的保守性，尤其是N端、C端（圖7）。

2.3.5?系統(tǒng)發(fā)育進化分析?在NCBI上搜索已經(jīng)發(fā)表的CPP-like家族的蛋白序列，除了氨基酸同源性分析的15個蛋白，還包括胡楊（XP_011026909.1;XP_011039720.1;XP_011019786.1）、銀白楊（TKR83702.1）、擬南芥（NP_001328549.1;NP_001328548.1;NP_193213.5;AEE83496.1;NP_566717.1）、月季（Rosa?chinensis，XP_024179390.1）、白梨（Pyrus?bretschneideri，XP_009345300.1）、絨毛狀煙草（Nicotiana?tomentosiformis，XP_009591884.1）、蕪菁（Brassica?rapa，XP_009135825.1）、野草莓?（Fragaria?vesca?subsp.?vesca，XP_011459206.1），共27個具有Tesmin/TSO1-like?CXC?2結(jié)構(gòu)域的蛋白序列進行進化樹構(gòu)建（圖8）。通過MEGA7軟件采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）法，設(shè)置參數(shù)自展值（Bootstrap值）為1?000次進行進化分析，結(jié)果顯示，北美鵝掌楸與蓮、胡楊的TCX2蛋白明顯聚成一個分支，說明三者進化關(guān)系較近。

2.4?北美鵝掌楸LtTCX2基因的組織特異性表達分析

將北美鵝掌楸花芽、根、葉、莖、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊共8個組織的總RNA參照說明書進行反轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA，以鵝掌楸的LcActin97為內(nèi)參基因，采用相對定量的方法進行RT-qPCR。檢測實線部分表示2個保守結(jié)構(gòu)域CXC;虛線部分表示保守的R序列，連接2個CXC結(jié)構(gòu)域。

Solid?lines?indicated?the?two?conserved?CXC?domains;?Dotted?lines?indicated?the?conserved?R?sequences?connecting?the?two?CXC?domains.LcActin97、LtTCX2基因在8個組織中的半定量表達情況，以檢驗熒光定量引物的特異性以及cDNA的質(zhì)量。由圖9：A可知，內(nèi)參基因LcActin97在8個組織中的表達量相對穩(wěn)定，條帶亮度相對一致，可以用于此8個組織的熒光定量PCR實驗，LtTCX2基因在8個組織中均有表達，在花芽、雄蕊、雌蕊、葉片中表達量較高。將LtTCX2基因的RT-qPCR實驗數(shù)據(jù)導(dǎo)出后，以花芽的表達量為參照，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，分析其在8個組織中的表達情況。由圖9：B可知，LtTCX2基因的半定量和熒光定量PCR表達結(jié)果相對一致，在葉片中表達量最高，花芽次之，花瓣、萼片中最少。

3?討論與結(jié)論

北美鵝掌楸花型優(yōu)美、花色變化豐富，花蜜量大，且較于鵝掌楸結(jié)實率高，是研究繁殖器官發(fā)育的較理想材料。目前，有關(guān)北美鵝掌楸花部器官發(fā)育分子調(diào)控的研究較少，且多集中于花色合成方面，雌蕊、雄蕊等繁殖器官發(fā)育調(diào)控起步較晚。CPP-like家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于各種生物中，主要參與生物的細(xì)胞分裂與性器官發(fā)育，目前研究多以動物為對象，在植物中研究較少，且起步較晚。本文在北美鵝掌楸中分離出1個CPP-like家族基因，命名為LtTCX2，全長2?866?bp，編碼區(qū)長2?424?bp，編碼了807個氨基酸。組織特異性表達分析表明，該基因在葉片中表達量最高，花芽次之，花瓣、萼片中最少，整體表達水平差異不大且水平不高，推測LtTCX2并不是調(diào)控北美鵝掌楸繁殖器官發(fā)育的主要基因。

目前關(guān)于植物CPP轉(zhuǎn)錄因子，既研究它們在細(xì)胞分裂與繁殖器官發(fā)育的調(diào)控，又聚焦于它們在植物系統(tǒng)進化歷程。通過對模式植物水稻和擬南芥生物信息分析發(fā)現(xiàn)，所有的CPP-like家族都具有高度保守的CRC結(jié)構(gòu)域，單子葉、雙子葉植物分化之前，植物CPP-like家族基因發(fā)生過大幅度的擴張（王凱，2010）。在單子葉和雙子葉植物分化完成之后，擬南芥和水稻基因組中的基因家族按照物種特異性方式進行擴張，擬南芥存在基因丟失現(xiàn)象，而兩段CXC結(jié)構(gòu)域序列及R序列在長期進化過程中是協(xié)同進化的（Yang?et?al.，2008）。但對除水稻、擬南芥以外的其他植物的CPP-like家族研究較少，亟待補充，且該家族在基部被子植物中的進化過程尚待探索與研究。本文經(jīng)過對北美鵝掌楸LtTCX2蛋白氨基酸序列分析以及結(jié)構(gòu)域預(yù)測，表明LtTCX2蛋白亦具有2個保守且富含半胱氨酸CXC結(jié)構(gòu)域C1和C2，以及連接C1、C2保守的R序列，具有完整的、高度保守的?CRC結(jié)構(gòu)域，再次說明了CRC結(jié)構(gòu)域的高度保守性。

根據(jù)被子植物的系統(tǒng)進化分析，被子植物分為基部被子植物和真雙子葉植物，真雙子葉植物可分為基部真雙子葉植物和核心真雙子葉植物。木蘭目、無油樟目和睡蓮目屬于基部被子植物，無油樟目和睡蓮目更接近基部被子植物，而木蘭藤目和核心被子植物處于并列的分支，北美鵝掌楸屬于典型的基部被子植物（Qiu?et?al.，2005;Jansen?et?al.，2007）。通過北美鵝掌楸LtTCX2蛋白系統(tǒng)進化樹構(gòu)建分析，表明北美鵝掌楸與亞洲蓮、胡楊的TCX2蛋白明顯聚成一個分支，說明三者進化關(guān)系較近。北美鵝掌楸LtTCX2與亞洲蓮進化關(guān)系較近，與木本植物的模式植物胡楊次之，其系統(tǒng)進化結(jié)果與被子植物進化進程相一致，說明CPP-like家族屬于較古老、保守的一類基因，可以為從分子生物學(xué)層面研究植物系統(tǒng)提供一定的理論幫助。目前關(guān)于其他植物CPP-like家族的研究匱乏，北美鵝掌楸更是鮮少見報。本文僅針對該家族中的1個基因進行了克隆與分析，初步探索其在基部被子植物中的表達、進化過程，日后仍需對其及其他成員繼續(xù)探索與研究，分析該家族基因在木蘭科中的進化關(guān)系及進化方式。

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（責(zé)任編輯?何永艷）