鵝掌楸AOX家族基因克隆與組織表達(dá)分析

宗亞仙 郝自遠(yuǎn) 王曦 溫少瑩 李火根

摘?要：鵝掌楸（Liriodendron?chinense）為重要的珍貴用材及園林觀賞樹(shù)種，開(kāi)展抗逆基因的研究，對(duì)于提高鵝掌楸適應(yīng)性有重要意義。該文以鵝掌楸為研究對(duì)象，通過(guò)采用RT-qPCR與RACE相結(jié)合的方法克隆獲得3個(gè)AOX基因，其ORF長(zhǎng)分別為858、1?032、1?044?bp，相應(yīng)編碼氨基酸數(shù)為285、343、347?aa，分別命名為L(zhǎng)cAOX1a、LcAOX1b和LcAOX2。蛋白同源性分析發(fā)現(xiàn)鵝掌楸AOX家族蛋白序列高度保守，尤其在C端保守性極高，且均含有“EXXH”、“EEE-Y”?鐵離子結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示LcAOX1a蛋白定位于線粒體及葉綠體之外的其他位置，LcAOX1b蛋白在葉綠體和線粒體中均有定位，LcAOX2蛋白定位于線粒體基質(zhì)。采用RT-qPCR方法研究AOX基因在鵝掌楸莖、葉片、葉芽、花芽、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊8個(gè)不同組織中的表達(dá)模式，分析發(fā)現(xiàn)鵝掌楸AOX基因在花器官中表達(dá)量明顯高于營(yíng)養(yǎng)器官，LcAOX1a與LcAOX1b基因在雄蕊中表達(dá)量最高，特別是LcAOX1a基因在雄蕊中特異性表達(dá)，其表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織;LcAOX2基因在花瓣中表達(dá)量最高。該研究克隆3個(gè)鵝掌楸AOX基因并進(jìn)行相關(guān)分析，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鵝掌楸，交替氧化酶，基因克隆，生物信息學(xué)分析，組織表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2020）07-0988-10

Abstract：Alternative?oxidase?（AOX），a?terminal?oxidase?located?in?respiration?electron-transport?pathway，which?is?widely?existed?in?higher?plants?and?closely?related?to?plant?respiration.?It?has?shown?that?AOX?played?a?substantial?role?in?plant?growth，seedling?morphogenesis?and?environmental?adaptability?in?recent?researches.?Liriodendron?chinensis?is?an?excellent?tree?species?for?garden?ornaments?and?timber?use，while?the?adaptive?capacity?prevents?the?expansion?of?cultivated?area.?As?a?result，searching?for?resistant?genes?of?L.?chinensis?and?uncovering?the?mechanism?of?its?stress-defence?ability?are?great?urgency.?Three?AOX?genes?were?isolated?from?L.?chinensis?by?RT-qPCR?and?RACE，and?then?sequence?analysis?was?carried?out?in?silico，including?analysis?of?open?reading?frames，encoded?amino?acid?sequences，protein?domains，secondary?structures?and?so?on.?The?open?reading?frame?length?of?AOX?genes?were?858，1?032?and?1?044?bp，which?encoded?285，343?and?347?amino?acids，respectively，and?then?we?named?the?genes?as?LcAOX1a，LcAOX1b?and?LcAOX2.?Protein?homology?and?phylogenesis?analysis?revealed?that?the?AOX?family?protein?sequences?of?L.?chinense?were?highly?conserved，especially?at?the?C-terminus，and?all?the?three?AOX?genes?contained?“EXXH”，“EEE-Y”?iron-binding?conserved?domains，those?may?have?activities?in?combination?with?iron?ions.?Subcellular?localization?analysis?showed?that?LcAOX1a?protein?was?localized?in?other?places?outside?the?chloroplast?and?mitochondria.?LcAOX1b?protein?was?localized?in?chloroplast?and?mitochondria，while?LcAOX2?protein?was?localized?in?mitochondrial?matrix.?The?expression?patterns?of?AOX?genes?were?examined?by?using?eight?tissues，including?stem，leaf，leaf?bud，flower?bud，calyx，petal，stamens?and?pistil.?The?result?of?RT-qPCR?indicated?that?relative?quantity?（RQ）?of?LcAOX1a，LcAOX1b?and?LcAOX2?genes?in?floral?organs?was?significantly?greater?than?that?in?vegetative?organs.?The?RQ?value?of?LcAOX1a?and?LcAOX1b?was?the?highest?in?the?stamens，especially?the?LcAOX1a，the?expression?in?the?stamens?was?much?higher?than?other?tissues.?The?LcAOX2?gene?has?the?highest?RQ?value?in?the?petals.?This?study?cloned?three?LcAOX?genes?and?performed?bioinformatics?analysis，subcellular?localization?analysis?and?expression?patterns?analysis?to?provide?a?reference?for?further?study?of?their?biological?functions.

1.2.4?基因的生物信息學(xué)分析?利用生物信息學(xué)軟件對(duì)獲得的AOX基因進(jìn)行開(kāi)放閱讀框、編碼的氨基酸序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及二級(jí)結(jié)構(gòu)等分析。通過(guò)ORF?finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）進(jìn)行ORF及編碼氨基酸序列的預(yù)測(cè);通過(guò)Expasy?ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行蛋白質(zhì)氨基酸組成、分子量、理論等電點(diǎn)分析;使用Pfam（http：//pfam.xfam.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析;采用在線工具ExPASy?TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）分析蛋白質(zhì)序列跨膜區(qū);使用SignalP?4.1?Sever（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號(hào)肽分析;使用SOPMA進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);分別利用TargetP?1.1?Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）及Wolfpsort（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè);在NCBI搜索下載已發(fā)表的AOX同源序列進(jìn)行分析，采用MEGA5.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.2.5?基因的組織表達(dá)分析?提取鵝掌楸葉片、莖、葉芽、花芽、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊8個(gè)不同組織的RNA，將提取的RNA樣品稀釋到統(tǒng)一濃度（250?ng·μL-1），反轉(zhuǎn)錄呈cDNA。根據(jù)克隆獲得LcAOX1a、LcAOX1b和LcAOX2基因序列，采用Oligo?7軟件設(shè)計(jì)qPCR引物（表1），用Actin97作為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)目的基因在8種不同組織中的表達(dá)量，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)體系和程序參照SYBR?Premix?Ex?TaqTM?（Tli?RNaseH?Plus）（TaKaRa）說(shuō)明書(shū)。

2?結(jié)果與分析

2.1?鵝掌楸AOX家族基因cDNA全長(zhǎng)序列克隆及命名

從北美鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)搜索到AOX基因相關(guān)的EST片段共16條，分別將其EST片段與本實(shí)驗(yàn)室鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（Yang，2013）比對(duì)、去重之后，共得到3條鵝掌楸AOX基因EST片段，分別為lcomp84206_c0、lcomp98789、lcomp99880_c0，并根據(jù)篩選出的3條鵝掌楸AOX基因EST序列設(shè)計(jì)中間片段特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增、目的片段回收以及克隆測(cè)序，對(duì)轉(zhuǎn)錄組中AOX基因序列進(jìn)行驗(yàn)證（圖1：A）。根據(jù)中間片段測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)RACE引物，采用巢式擴(kuò)增，獲得3′RACE（圖1：C）和5′RACE（圖1：D）。將中間片段、3′RACE和5′RACE進(jìn)行電子拼接獲得全長(zhǎng)，并在其ORF兩端設(shè)計(jì)引物進(jìn)行ORF驗(yàn)證（圖1：B），表明拼接結(jié)果無(wú)誤。將克隆獲得的3個(gè)AOX基因預(yù)測(cè)蛋白通過(guò)NCBI?BLAST?Protein與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，將獲得的目的基因依次命名為L(zhǎng)cAOX1a（MN187966）、LcAOX1b（MN187968）和LcAOX2（MN187967）。

2.2?鵝掌楸AOX家族基因編碼蛋白理化性質(zhì)分析

克隆出的3個(gè)AOX基因編碼蛋白均含有AOX保守結(jié)構(gòu)域，其中LcAOX1a、LcAOX1b為AOX1亞家族，LcAOX2為AOX2亞家族成員。LcAOX1a基因全長(zhǎng)1?305?bp，ORF長(zhǎng)858?bp，編碼285個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為7.23，脂溶性蛋白指數(shù)為80.11，不穩(wěn)定系數(shù)為36.17，疏水性平均值為-0.264。LcAOX1b基因全長(zhǎng)1?405?bp，ORF長(zhǎng)1?032?bp，編碼343個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為8.37，脂溶性蛋白指數(shù)為85.04，不穩(wěn)定系數(shù)為39.71，疏水性平均值為-0.181。LcAOX2基因全長(zhǎng)1?376?bp，ORF長(zhǎng)1?044?bp，編碼347個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)9.02，脂溶性蛋白指數(shù)為89.94，不穩(wěn)定系數(shù)為48.17，疏水性平均值為-0.251。通過(guò)在線預(yù)測(cè)軟件ExPASy?TMpred對(duì)AOX蛋白跨膜區(qū)進(jìn)行解析，結(jié)果顯示AOX蛋白為典型的跨膜蛋白，且疏水性變化大的區(qū)域?yàn)槠淇缒^(qū)。

2.3?鵝掌楸AOX家族基因編碼蛋白同源性分析

分別將鵝掌楸AOX家族蛋白的LcAOX1a、LcAOX1b、LcAOX2與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明鵝掌楸AOX家族蛋白序列高度保守，尤其在C端保守性極高（圖2），且不同物種AOX蛋白均含有AOX家族特有的“EXXH”、“EEE-Y”鐵離子結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域，6個(gè)保守的組氨酸殘基可能參與鐵離子的結(jié)合，1個(gè)保守絲氨酸殘基則與二硫鍵形成有關(guān)，因此，推測(cè)克隆出的LcAOX1a、LcAOX1b、LcAOX2基因作為雙鐵羧酸超基因家族成員，有著結(jié)合鐵離子活性。

2.4?鵝掌楸AOX家族基因表達(dá)蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索已發(fā)表的擬南芥（NP_188876.1、NP_188875.1、NP_189399.1、NP_201226.2）、水稻（Oryza?sativa，O.?glaberrima）（BAA28773.1、BAB71945.1）、胡蘿卜（Daucus?carota?var.?sativa）（ALI57378.1、ABZ81229.2、ABZ81230.2）、葡萄（Vitis?vinifera）（ACI28876.1、NP_001268001.1）、番茄（Lycopersicon?esculentum）（NP_001234117.2、NP_001309890.1）、大豆（Glycine?max）（KHN42869.1、KHN39226.1）、西瓜（Citrullus?lanatus）（ADD84880.1）

等19個(gè)AOX家族同源蛋白，利用MEGA5.0軟件將3個(gè)鵝掌楸AOX蛋白與數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，并用極大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3），AOX蛋白明顯分為兩大支，即AOX1和AOX2，從親緣關(guān)系來(lái)看，LcAOX1a和LcAOX1b

聚為一個(gè)小的分支，與胡蘿卜DcAOX1蛋白親緣關(guān)系最近;而LcAOX2與胡蘿卜DcAOX2a等蛋白親緣關(guān)系較近。因此，該結(jié)果一方面說(shuō)明了鵝掌楸在進(jìn)化關(guān)系上與胡蘿卜更為密切，另一方面，也符合AOX家族在AOX1和AOX2亞家族分類事實(shí)。

2.5?鵝掌楸AOX家族基因亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

用TargetP在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)（表2），結(jié)果顯示LcAOX1a蛋白可能較多分布在除葉綠體、線粒體和分泌通路之外的其他位置;LcAOX2蛋白定位于線粒體，且可信度等級(jí)為2，具有較高可信度;LcAOX1b雖然在線粒體中分值最高，但其具體定位信息并不明確。為了使預(yù)測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，我們使用Wolfpsort在線軟件再一次進(jìn)行LcAOX蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)（表3），結(jié)果顯示LcAOX1a蛋白最有可能定位于細(xì)胞質(zhì)區(qū)域;LcAOX2蛋白最有可能定位于線粒體中;LcAOX1b蛋白在線粒體和葉綠體中均有定位，其具體定位信息仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.6?鵝掌楸AOX家族基因組織表達(dá)特性分析

分別提取鵝掌楸的8個(gè)組織總RNA，以其反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，參考之前已發(fā)表的鵝掌楸Actin97作為內(nèi)參基因（Tu?et?al.，2019），進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示（圖4），三個(gè)AOX基因在花器官中表達(dá)量均明顯高于其在營(yíng)養(yǎng)器官中的表達(dá)量。其中鵝掌楸AOX1a在雄蕊中表達(dá)量極高，其次為花瓣，而在莖、葉片、葉芽等組織中表達(dá)量極低，僅有1左右;同樣，AOX1b基因在雄蕊中表達(dá)量最高，約為葉片的2.69倍，莖中表達(dá)量最低，只有葉片的0.2倍左右;AOX2基因在花瓣中表達(dá)量最高，約為葉片表達(dá)量的3倍左右，葉芽中表達(dá)量最低。

3?討論與結(jié)論

交替氧化酶為交替呼吸途徑末端氧化酶，是由AOX基因控制編碼的一類蛋白酶，Rhoads?&?Mcintosh（1991）在斑龍芋（Sauromatum?venosum）中首次克隆出AOX基因并命名為AOX1。隨后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)交替呼吸途徑以及AOX基因進(jìn)行了大量研究。迄今為止，幾乎在所有的高等植物基因組中均檢測(cè)到AOX基因的存在，而在動(dòng)物中，只有極少數(shù)低等動(dòng)物如原生生物中含有AOX基因（Mcdonald?&?Vanlerberghe，2004），此外，在真菌、細(xì)菌以及藻類中都有發(fā)現(xiàn)（Mcdonald?&?Vanlerberghe，2006）。AOX基因家族是由核基因編碼的一個(gè)較小的基因家族，通常被分為兩個(gè)亞家族AOX1和AOX2（Selinski?et?al.，2018），多數(shù)單子葉植物中往往僅含有AOX1亞家族，但天南星科植物如綠萍、紅掌、綠蘿等古老的單子葉植物中也檢測(cè)到AOX2亞家族的存在（Costa?et?al.，2017），此外，對(duì)石頭松（Pinus?pinea）的研究發(fā)現(xiàn)，其含有AOX1和AOX2兩個(gè)亞家族，可以推斷AOX1和AOX2兩個(gè)亞家族出現(xiàn)在裸子植物與被子植物分離之前的時(shí)期，并且證明單子葉植物中也存在AOX2亞家族，可能在之后的進(jìn)化發(fā)展中逐漸丟失了相關(guān)序列（António?et?al.，2009）;而雙子葉植物除了極個(gè)別物種如楊樹(shù)（Populus）外（楊樹(shù)僅存在AOX1亞家族），均含有兩個(gè)亞家族（張旭，2014）。擬南芥AOX基因家族分析結(jié)果表明，共有5個(gè)AOX基因存在擬南芥中，其中有4個(gè)AOX1基因分別為AOX1a、AOX1b、AOX1c、AOX1d以及1個(gè)AOX2基因（Saisho?et?al.，1997;Clifton?et?al.，2005）。對(duì)大豆研究發(fā)現(xiàn)其存在1個(gè)AOX1基因和2個(gè)AOX2基因分別為AOX2a和AOX2b（Thirkettle-Watts?&?Whelan，2003）。Ito?et?al.（1997）從水稻中分離鑒定出兩個(gè)AOX基因，分別命名為AOX1a、AOX1b，此后Hiroaki?et?al.（2002）進(jìn)一步對(duì)水稻研究發(fā)現(xiàn)并命名為AOX1c基因，三者均為AOX1亞家族基因。

本研究依據(jù)鵝掌楸多組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選鑒定并克隆3個(gè)AOX家族基因LcAOX1a、LcAOX1b、LcAOX2，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明鵝掌楸AOX基因同樣分化為AOX1與AOX2兩個(gè)亞家族。

根據(jù)“SUM”模型（Siedow?&?Umbach，1995），AOX蛋白在第一和第四個(gè)螺旋分別含有1個(gè)保守的?“EXXH”，形成雙鐵羧酸活性中心，且在C端含有“FXHR”與“EEE-Y”的保守序列。而在此后Andersson?&?Nordlund（1999）提出的“AN”模型中，AOX在第二和第四個(gè)螺旋中含有“EXXH”保守序列，且活性中心僅位于第四個(gè)螺旋。本研究進(jìn)行蛋白同源性分析發(fā)現(xiàn)鵝掌楸AOX家族3個(gè)基因均含有AOX家族特有的“EXXH”“FXHR”“EEE-Y”等鐵離子結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域，尤其在C端保守性極高。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示LcAOX1a蛋白可能分布在除線粒體、葉綠體和分泌通路之外的其他位置;LcAOX1b在葉綠體和線粒體中均有定位;LcAOX2蛋白定位于線粒體，這與之前報(bào)道的對(duì)擬南芥AOX2基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，并且該研究發(fā)現(xiàn)AOX2基因在擬南芥萌發(fā)初期的交替呼吸途徑中發(fā)揮重要作用（Saisho?et?al.，2001）。

組織表達(dá)分析結(jié)果表明鵝掌楸LcAOX1a、LcAOX1b與LcAOX2基因均在生殖器官中表達(dá)量較高，其中LcAOX1a與LcAOX1b基因均在雄蕊中表達(dá)量最高，特別是LcAOX1a基因在雄蕊中表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織。AOX基因作為重要的線粒體末端氧化酶，在能量溢流和熱能轉(zhuǎn)化過(guò)程中具有重要的作用，然而在開(kāi)花傳粉期間，可能由于花器官需要熱量維持活躍的代謝反應(yīng)，因此表現(xiàn)出AOX活性的顯著增強(qiáng)（Meeuse，1975）。LcAOX1a基因在雄蕊中特異性表達(dá)，雄蕊表達(dá)量是葉片的2萬(wàn)倍以上，推測(cè)該基因除了與非生物脅迫相關(guān)之外，可能與雄蕊發(fā)育密切相關(guān)。與此結(jié)果相似，在對(duì)大豆、棉花（Gossypium?spp.）和擬南芥研究中發(fā)現(xiàn)AOX1基因均表現(xiàn)出雄蕊特異性表達(dá)，且AOX1基因的雄蕊特異性表達(dá)模式與細(xì)胞質(zhì)雄性不育有著密切的關(guān)系（Shin?et?al.，2002;Li?et?al.，2013）。此外，對(duì)蘇鐵產(chǎn)熱機(jī)制研究表明，雄球果產(chǎn)熱明顯高于雌球果，而獨(dú)特的線粒體形態(tài)和CrAOX1介導(dǎo)的小孢子呼吸可能在球果產(chǎn)熱中發(fā)揮重要作用（Yasuko?et?al.，2019）。也有一些研究表明AOX1基因的表達(dá)并不引起細(xì)胞質(zhì)的雄性不育，而是與小孢子母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)（Johns?et?al.，1993）。而LcAOX2基因同樣在生殖器官中表達(dá)量更高，其中花瓣中表達(dá)量最高，其次為花萼和雌蕊。在西瓜和芒果的研究中發(fā)現(xiàn)AOX2在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中有大量表達(dá)，推斷AOX2可能與果實(shí)發(fā)育相關(guān)（Considine，2001;李嚴(yán)曼，2011）。擬南芥研究中發(fā)現(xiàn)AOX2在成熟的種子中表達(dá)量最高（Nakabayashi?et?al.，2005）。因此推測(cè)AOX2可能與植物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。在對(duì)本研究通過(guò)對(duì)鵝掌楸AOX基因序列克隆并探討其組織表達(dá)模式與功能之間的潛在關(guān)系，以期為今后進(jìn)一步開(kāi)展AOX家族基因生物學(xué)功能研究提供參考。

參考文獻(xiàn)：

ANDERSSON?ME，NORDLUND?P，1999.?A?revised?model?of?the?active?site?of?alternative?oxidase[J].?Febs?Letters，449（1）：?17-22.

ANTNIO?MF，ZAVATTIERI?MA，CAMPOS?MD，et?al.，2009.?The?gymnosperm?Pinus?pinea?contains?both?AOX?gene?subfamilies，AOX1?and?AOX2[J].?Physiol?Plantarum，137（4）：?566-577.

BONNER?WD，RICH?PR，1986.?Partial?purification?and?characterization?of?the?quinol?oxidase?activity?of?Arum?maculatum?mitochondria[J].?Plant?Physiol，80（4）：838-842.

CHINNUSAMY?V，ZHU?J，ZHU?JK，2007.?Cold?stress?regulation?of?gene?expression?inplants[J].?Trends?Plant?Sci，12（10）：444-451.

CLIFTON?R，LISTER?R，PARKER?KL，et?al.，2005.?Stress-induced?co-expression?of?alternative?respiratory?chain?components?in?Arabidopsis?thaliana[J].?Plant?Mol?Biol，58（2）：?193-212.

CONSIDINE?MJ，2001.?The?expression?of?alternative?oxidase?and?uncoupling?protein?during?fruit?ripening?in?mango[J].?Plant?Physiol，126（4）：1619-1629.

COSTA?JH，SANTOS?CPD，BEATRIZ?DSEL，et?al.，2017.?In?silico?identification?of?alternative?oxidase?2?（AOX2）?in?monocots：A?new?evolutionary?scenario[J].?J?Plant?Physiol，210：58-63.

DOROTEIA?CM，AMAIA?N，CARDOSO?HLIA?G，et?al.，2016.?Stress-induced?accumulation?of?DcAOX1?and?DcAOX2a?transcripts?coincides?with?critical?time?point?for?structural?biomass?prediction?in?carrot?primary?cultures?（Daucus?carota?L.）[J].?Frontiers?Genet，7：1-17

HAO?RM，HE?SA，1995.?Geographical?distribution?of?Liriodendron?chinense?in?China?and?its?significance[J].?J?Plant?Resour?Environ，4（1）：1-6.[郝日明，賀善安，1995.?鵝掌楸在中國(guó)的自然分布及其特點(diǎn)[J].?植物資源與環(huán)境，4（1）：?1-6.]

HIROAKI?S，KAZUHIRO?O，SAWAKO?H，et?al.，2002.?AOX1c，a?novel?rice?gene?for?alternative?oxidase，comparison?with?rice?AOX1a?and?AOX1b[J].?Genes?Genet?Syst，77（1）：31-38.

ITO?Y，SAISHO?D，NAKAZONO?M，et?al.，1997.?Transcript?levels?of?tandem-arranged?alternative?oxidase?genes?in?rice?are?increased?by?low?temperature[J].?Gene，203（2）：121-129.

JIAN?W，ZHANG?DW，ZHU?F，et?al.，2016.?Alternative?oxidase?pathway?is?involved?in?the?exogenous?SNP-elevated?tolerance?of?Medicago?truncatula?to?salt?stress[J].?J?Plant?Physiol，193：79-87.

JOHNS?C，NICKELS?R，MCINTOSH?L，et?al.，1993.?The?expression?of?alternative?oxidase?and?alternative?respiratory?capacity?in?cytoplasmic?male?sterile?common?bean[J].?Sexual?Plant?Reprod，6（4）：257-265.

KEUNEN?E，F(xiàn)LOREZ-SARASA?I，OBATA?T，et?al.，2016.?Metabolic?responses?of?Arabidopsis?thaliana?roots?and?leaves?to?sublethal?cadmium?exposure?are?differentially?influenced?by?alternative?oxidase1a[J].?Environ?Exp?Bot，124：64-78

LI?KQ，2013.?Studies?on?population?genetics?and?molecular?phylogeography?of?Liriodendron[D].?Nanjing：Nanjing?Forestry?University.[李康琴，2013.?鵝掌楸屬群體遺傳結(jié)構(gòu)及分子系統(tǒng)地理學(xué)研究[D].?南京：南京林業(yè)大學(xué).]

LI?Y，JIANG?J，DU?ML，et?al.，2013.?A?cotton?gene?encoding?MYB-Like?transcription?factor?is?specifically?expressed?in?pollen?and?is?involved?in?regulation?of?late?anther/pollen?development[J].?Plant?Cell?Physiol，54（6）：893-906.

LI?YM，ZHU?L，YANG?JH，et?al.，2011.?Cloning?and?analysis?of?the?alternative?oxidase-2（AOX2）?gene?in?watermelon[J].?J?Fruit?Sci，28（5）：909-914.[李嚴(yán)曼，朱磊，楊景華，等，2011.?西瓜交替氧化酶AOX2基因的克隆與分析[J].?果樹(shù)學(xué)報(bào)，28（5）：909-914.]

MCDONALD?AE，VANLERBERGHE?GC，2004.?Branched?mitochondrial?electron?transport?in?the?animalia：Presence?of?alternative?oxidase?in?several?animal?phyla[J].?Iubmb?Life，56（6）：333-341

MCDONALD?AE，VANLERBERGHE?GC，2006.?Origins，evolutionary?history，and?taxonomic?distribution?of?alternative?oxidase?and?plastoquinol?terminal?oxidase[J].?Comparative?Biochem?Physiol?Part?D：Genom?and?Proteom，1（3）：357-364.

MEEUSE?BJ，1975.?Thermogenic?respiration?in?Aroids[J].?Ann?Review?Plant?Biol，26（1）：117-126.

NAKABAYASHI?K，OKAMOTO?M，KOSHIBA?T，et?al.，2005.?Genome-wide?profiling?of?stored?mRNA?in?Arabidopsis?thaliana?seed?germination：Epigenetic?and?genetic?regulation?of?transcription?in?seed[J].?Plant?J，41（5）：697-709.

RHOADS?D?M，MCINTOSH?L，1991.?Isolation?and?characte-rization?of?a?cDNA?clone?encoding?an?alternative?oxidase?protein?of?Sauromatum?guttatum?（Schott）[J].?Proc?Natl?Acad?Sci?USA，88（6）：2122-2126.

SAISHO?D，NAKAZONO?M，LEE?KH，et?al.，2001.?The?gene?for?alternative?oxidase-2?（AOX2）?from?Arabidopsis?thaliana?consists?of?five?exons?unlike?other?AOX?genes?and?is?transcribed?at?an?early?stage?during?germination[J].?Genes?Genet?Syst，76（2）：89-97.

SAISHO?D，NAMBARA?E，NAITO?S，et?al.，1997.?Characte-rization?of?the?gene?family?for?alternative?oxidase?from?Arabidopsis?thaliana[J].?Plant?Mol?Biol，35（5）：585-596.

SELINSKI?J，SCHEIBE?R，DAY?DA，et?al.，2018.?Alternative?oxidase?is?positive?for?plant?performance[J].?Trends?Plant?Sci，23（7）：588-597.