鉀離子通道與骨肉瘤研究進(jìn)展*

吳進(jìn)，陳云萍，陳志達(dá)

363000 福建 漳州，聯(lián)勤保障部隊(duì)第909醫(yī)院暨廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院 骨科(吳進(jìn)、陳志達(dá))；362000 福建 泉州，聯(lián)勤保障部隊(duì)第910醫(yī)院 腫瘤科(陳云萍)

骨肉瘤是青少年最常見(jiàn)的惡性骨腫瘤，嚴(yán)重影響青少年生命健康[1]。即使采用外科手術(shù)聯(lián)合新輔助化療的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，患者預(yù)后已進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定的停滯期：無(wú)肺轉(zhuǎn)移患者 5 年生存率僅為 65%，發(fā)生肺轉(zhuǎn)移患者預(yù)后更差[2-3]。因此深入研究與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展和治療相關(guān)的分子機(jī)制，是骨肉瘤目前研究最為關(guān)注的疑難問(wèn)題，也是突破骨肉瘤生存預(yù)后瓶頸的關(guān)鍵。

鉀離子通道是迄今為止發(fā)現(xiàn)的分布最廣、亞型最多、作用最復(fù)雜的一類蛋白分子。它們廣泛存在于各組織的細(xì)胞膜表面，在所有可興奮性和非可興奮性細(xì)胞的重要信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中扮演著重要的角色。此外，其家族成員在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、心率、胰島素分泌、神經(jīng)細(xì)胞分泌、上皮細(xì)胞電傳導(dǎo)、骨骼肌收縮及細(xì)胞容積等過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。近年來(lái)研究表明，鉀離子通道不僅參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)、維持細(xì)胞膜電位、細(xì)胞間信號(hào)傳遞等生理活動(dòng)，而且與包括骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，提示該通道可能成為潛在的腫瘤診斷標(biāo)志和治療靶點(diǎn)[4]。由此，骨肉瘤細(xì)胞膜上鉀離子通道的研究成為熱點(diǎn)之一。

1 鉀離子通道結(jié)構(gòu)和分類

1.1 鉀離子通道結(jié)構(gòu)

包含6個(gè)跨膜的α螺旋(功能區(qū)段，分別命名為S1-S6區(qū))、一個(gè)保守的離子選擇性的離子區(qū)P-domian(P區(qū))以及留在胞漿內(nèi)的自由氨基(N)末端和自由羧基(C)末端，是由4個(gè)重復(fù)亞基連接在一起的多肽組成(圖1)。

圖1 鉀離子通道的結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 鉀離子通道分類

根據(jù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，可將鉀離子通道劃分為四大類：

1.2.1 電壓門控型離子通道(voltage-gated potassium channel,Kv) 主要由α亞基超家族和β輔助亞基兩部分組成的復(fù)合體[5]，具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)和1個(gè)孔區(qū)，是成員最多的鉀離子通道家族。一直以來(lái)沒(méi)有一個(gè)全面準(zhǔn)確的Kv通道分類方法。研究者們?cè)?jīng)廣泛使用跨膜結(jié)構(gòu)域和KCN分類法，但都存在一定的缺陷。較新的分類方法根據(jù)通道蛋白的種系和發(fā)生特點(diǎn)，可將Kv家族分為三類12個(gè)亞族[6](圖2)。

1.2.2 鈣激活型鉀離子通道(Ca2+activated potassium channel,BK) 與Kv通道的組成類似，也是由α亞基超家族和β輔助亞基兩部分組成。α亞基超家族相應(yīng)位點(diǎn)的突變能改變膜上鈣激活的鉀電流，因此BK通道又被稱為dSlo。

1.2.3 內(nèi)向整流型鉀離子通道(inwardly rectifying potassium channel,Kir) 具有2個(gè)跨膜段和1個(gè)孔區(qū)的鉀離子通道亞型，因其內(nèi)向電流顯著大于外向電流而得名。ATP敏感型鉀離子通道 (adenosine triphosphate-sensitive potassium channel,KATP) 在結(jié)構(gòu)及電生理特點(diǎn)屬于Kir，其本質(zhì)即為Kir和磺脲酸受體共同組裝而成。

圖2 Kv 家族樹狀圖

1.2.4 雙孔型鉀離子通道(tandem-pore-domain potassium channels,K2p) 具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)和2個(gè)孔區(qū)，該通道無(wú)電壓依賴性，但對(duì)細(xì)胞膜外的機(jī)械力、PH值變化非常敏感，以此調(diào)控通道的活性[7]。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的性質(zhì)可分為6個(gè)亞族[8]：1)TWIK-1、TWIK-2和KCNK7；2)TAKS-1、TAKS-3、TAKS-5；3)TREK-1、TREK-2和TRAAK；4)TASK-2、TALK-1和TALK-2；5)THIK-1和THIK-2；6)TRESK。

2 鉀離子通道與骨肉瘤研究進(jìn)展

2.1 Kv通道與骨肉瘤研究進(jìn)展

Kv通道是目前與骨肉瘤關(guān)系研究最多的亞族。吳進(jìn)等[9-10]應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)對(duì)人骨肉瘤MG63、Saos-2和SOSP-9607細(xì)胞中相關(guān)Kv通道，包括Kv1.1、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1、Kv3.3/3.4、Kv4.1、Kv5.1、Kv9.3、Kv10.1(ether à go-go1,Eag1)和Kv11.1(human related ether à go-go gene1,Erg1)的基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1、Kv3.3/3.4、Kv4.1、Kv5.1、Kv9.3、Kv10.1和Kv11.1通道基因在3株骨肉瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，而Kv5.1通道基因只在MG63細(xì)胞中表達(dá)。非特異性的電壓門控性鉀離子通道抑制劑4-氨基吡啶(4-aminopyridine,4-AP)在3 mM和5 mM時(shí)對(duì)三株細(xì)胞增殖影響明顯，并可阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期。而另一種非特異性抑制劑氯化銫在5 mM時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖及周期也有影響，但與4-AP相比，影響程度較小。陳志達(dá)等[11]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)、蛋白免疫印跡法(Western blotting)和免疫組化檢測(cè)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞中Kv1.3表達(dá)，分別采用CCK-8法、裸鼠骨肉瘤異種移植模型和流式細(xì)胞儀檢測(cè)特異性干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默Kv1.3表達(dá)前后MG-63細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和凋亡的變化，采用Western blotting檢測(cè)MG-63細(xì)胞中多聚ADP核糖聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP]和半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：抑制Kv1.3表達(dá)能從體內(nèi)外水平有效地抑制MG-63細(xì)胞增殖并促進(jìn)其早期凋亡，可能機(jī)制為誘導(dǎo)Caspase-3表達(dá)和PARP裂解。陳志達(dá)等[12]構(gòu)建了特異性沉默Kv1.5的siRNA，并分別采用CCK-8法、克隆形成率、流式細(xì)胞儀和Tunel法檢測(cè)沉默前后人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、周期和凋亡的變化，采用qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞中周期和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默Kv1.5表達(dá)可明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。機(jī)制研究結(jié)果顯示：沉默Kv1.5表達(dá)可下調(diào)骨肉瘤中Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)和Bik的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)p21、p27、Bax、Bcl-XL和Caspase-3基因的表達(dá)。Lee等[13]研究發(fā)現(xiàn)Kv7.5在犬骨肉瘤CCL-183細(xì)胞中呈高表達(dá)，采用Kv7.5通道開放劑可以抑制CCL-183細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，而Kv7.5通道的抑制劑則可通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達(dá)抑制Kv7.5活性，實(shí)現(xiàn)促CCL-183細(xì)胞增殖的效果。

Eag1及其編碼的Eag1通道是第一個(gè)被證明與腫瘤密切相關(guān)的鉀離子通道[14]。2014年P(guān)ardo等[15]在《Nature Reviews Cancer》雜志上發(fā)表文章，將Eag1視為確定的癌基因和有效的腫瘤治療靶點(diǎn)(圖3)。近年來(lái)，Eag1已成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)并不斷有新進(jìn)展[16-17]。Wu等[18-23]對(duì)于Eag1與骨肉瘤關(guān)系進(jìn)行了系列研究，結(jié)果顯示：1)Eag1在人骨肉瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)與其在良性骨腫瘤和正常成骨細(xì)胞中的表達(dá)有顯著差異性；2)Eag1可分別作用于下游靶點(diǎn)絲分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)、CyclinD1/E和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B/AKT)信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨肉瘤增殖、周期、血管生成和侵襲;3)miR-34a在人骨肉瘤中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-34a可抑制人骨肉瘤增殖和Eag1表達(dá)，而抑制miR-34a表達(dá)可誘導(dǎo)Eag1表達(dá)，提示Eag1可能是miR-34a的靶分子并受其負(fù)反饋調(diào)節(jié)；4)Eag1具有成為新的有效的骨肉瘤治療靶點(diǎn)的潛能。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)可激活骨肉瘤中的miR-34a-E2F1/3-Eag1信號(hào)通路抑制Eag1表達(dá)，從而達(dá)到治療Eag1高表達(dá)的骨肉瘤的目的(圖4)。而Eag1與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體聯(lián)合抑制或可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。

圖3 Eag1具有致癌潛能并可作為潛在的腫瘤標(biāo)志物

Erg1基因及其編碼的Erg1通道是腫瘤研究領(lǐng)域的另一個(gè)熱點(diǎn)。Erg1選擇性表達(dá)于多種組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系及原代腫瘤細(xì)胞，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡，與腫瘤的侵襲力和化療敏感性密切相關(guān)[24-25]。甘璐[26]研究發(fā)現(xiàn)，Erg1的表達(dá)水平隨著骨腫瘤的起源不同、惡性程度不同而存在差異。在良性或低度惡性的骨腫瘤中，Erg1不表達(dá)或者低度表達(dá)，而在高度惡性的骨腫瘤包括骨肉瘤中，Erg1多數(shù)呈高表達(dá)。在人骨肉瘤MG63、SOSP-9607、和Saos-2細(xì)胞中Erg1均有較高水平的表達(dá)，而部分鉀離子通道抑制劑可明顯抑制此三株腫瘤細(xì)胞系的增殖。贠喆等[27]進(jìn)一步研究證實(shí)：在人骨肉瘤SOSP-9607和MG-63細(xì)胞中，Erg1在蛋白水平陽(yáng)性表達(dá)，通過(guò)干擾RNA抑制Erg1在兩株骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)后，骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯減弱。Zeng等[28]研究發(fā)現(xiàn)：Erg1通過(guò)調(diào)控核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號(hào)通路中的細(xì)胞凋亡抑制蛋白-1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1,cIAP-1)、X染色體連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor-of-apoptosis protein，XIAP)、Bcl-2、Survivin、磷酸化NF-κB抑制因子(inhibitor of NF-κB, IκBα)和NF-κB p65的活性和表達(dá)水平參與了骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的過(guò)程并有望成為骨肉瘤治療和診斷的新靶點(diǎn)。陳志達(dá)等[29]研究發(fā)現(xiàn)：Erg1可能通過(guò)調(diào)控Hippo信號(hào)通路中的大腫瘤抑制因-1(large tumor suppressor gene 1,LATS1)和Yes激酶相關(guān)蛋白(yes-associated protein,YAP)的活性參與骨肉瘤的侵襲過(guò)程。

圖4 ATRA調(diào)控miR-34a-E2F1/3-Eag1信號(hào)通路抑制骨肉瘤惡性表型的模式圖

2.2 BK通道與骨肉瘤研究進(jìn)展

Rezzonico等[30]研究發(fā)現(xiàn)BK通道人骨肉瘤MG63細(xì)胞中異常高表達(dá)。應(yīng)用前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)可以誘導(dǎo)BK通道開放，機(jī)制為募集α亞基超家族hSlo通道上的多種磷酸化蛋白激酶。而hSlo又可與Syk酪氨酸激酶形成復(fù)合體，成為PGE2調(diào)控骨重塑和改造過(guò)程的中間轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。Rezzonico等[31]后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)：在人骨肉瘤MG-3和Cal72細(xì)胞及人正常成骨細(xì)胞中，機(jī)械壓力的改變?nèi)绲蜐B環(huán)境等可誘導(dǎo)粘著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)與細(xì)胞內(nèi)的部分hSlo通道相結(jié)合形成復(fù)合體，從而持續(xù)性地激活BK通道。Cambiem等[32]設(shè)計(jì)了4對(duì)針對(duì)hSlo通道的特異性干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)—hSlo370、hSlo734、hSlo3106和hSlo3301,并檢測(cè)了其沉默效能。之后的研究發(fā)現(xiàn)特異性沉默hSlo通道可以促裸鼠骨肉瘤生長(zhǎng)(人骨肉瘤Cal72細(xì)胞)，可能的機(jī)制為BK通道通過(guò)調(diào)控趨化因子CCL2和CCL20表達(dá)及白細(xì)胞的浸潤(rùn)來(lái)實(shí)現(xiàn)促骨肉瘤發(fā)生的效果。

2.3 Kir通道與骨肉瘤研究進(jìn)展

Kawase等[33]研究發(fā)現(xiàn)在人骨肉瘤UMR 106細(xì)胞和人成骨RCOB-3細(xì)胞中，降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)可通過(guò)誘導(dǎo)超極化激活細(xì)胞膜上的KATP通道，導(dǎo)致地爾硫卓敏感型鈣離子通道關(guān)閉和鈣的吸收抑制。該研究團(tuán)隊(duì)后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)：在人骨肉瘤UMR 106細(xì)胞中，CGRP通過(guò)激活KATP通道打開導(dǎo)致鉀離子外流，從而出現(xiàn)細(xì)胞膜的超極化、部分鈣離子通道關(guān)閉和鈣的吸收抑制等一系列過(guò)程。此過(guò)程可能誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)改變，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化等過(guò)程[34]。Pangalos等[35]應(yīng)用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)超極化可激活人成骨細(xì)胞和人骨肉瘤MG63細(xì)胞中Kir通道電流，而去極化則可激活部分電壓門控型鈉離子(voltage-gated sodium channel,Nav)和鉀離子通道。進(jìn)一步的RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)上述兩株細(xì)胞中，多種通道包括Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Kir2.1、Kir2.3、Kir2.4和Kv2.1均有表達(dá)。近年來(lái)在線粒體膜上發(fā)現(xiàn)了一種新型的KATP通道-線粒體KATP通道(mitochondria KATP,mitoKATP)。該通道是線粒體內(nèi)膜上的跨膜蛋白，主要是由Kir通道和ATP結(jié)合蛋白超家族(SUR)組成的異構(gòu)八聚體，因其能偶聯(lián)細(xì)胞內(nèi)的能量代謝狀態(tài)與鉀離子跨膜流動(dòng)和膜興奮性，mitoKATP通道受到越來(lái)越多的關(guān)注[36]。Butler等[37]應(yīng)用免疫組化和光學(xué)顯微鏡發(fā)現(xiàn)在人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞中mitoKATP的亞型Kir6.2在線粒體中呈低表達(dá)，而另一種亞型Kir6.1卻沒(méi)有表達(dá)。

2.4 K2p通道與骨肉瘤研究進(jìn)展

董學(xué)海[38]和Li等[39]研究了雙孔鉀離子通道亞型TASK-1、TASK-2和TASK-3在人骨肉瘤MG63細(xì)胞中的表達(dá)及分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TASK-1、TASK-2和TASK-3離子通道定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞核周圍。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在酸中毒條件下，MG63細(xì)胞增殖能力較PH 7.4環(huán)境明顯降低。同時(shí)，這種酸中毒對(duì)細(xì)胞增殖的影響沒(méi)有時(shí)間依賴性。上述結(jié)果提示TASK通道可能與人骨肉瘤細(xì)胞增殖有密切關(guān)系。

3 總結(jié)與展望

鉀離子通道對(duì)細(xì)胞跨膜電位的影響不僅引起Ca2+內(nèi)流的變化，還和Na+依賴性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)PH等有關(guān)。更讓研究人員感興趣的是即使利用某些藥物阻斷部分鉀離子通道電流(廢除鉀離子通道如Kv10.1的離子通道特性)并不影響其促腫瘤發(fā)生的能力，所以部分鉀離子通道在促腫瘤發(fā)生中并不僅僅表現(xiàn)為離子通道的特性[14]。因此，隨著研究的深入，鉀離子通道必將應(yīng)用于骨肉瘤的診斷和治療，成為診斷骨肉瘤早期發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)移的標(biāo)志蛋白，還可以通過(guò)抑制離子通道來(lái)抑制骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，開發(fā)出一批針對(duì)鉀離子通道的治療骨肉瘤的新型藥物。

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