PD1多態(tài)性與晚期非小細(xì)胞肺癌鉑類化療敏感性及骨髓抑制的關(guān)系*

趙萬，奉林，余玲玲，許麗華，程文秀

215153 江蘇 蘇州，南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院 腫瘤科

肺癌是全世界發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤，5年生存率僅16%[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數(shù)的85%，并且新發(fā)病例中約2/3是晚期患者，化療是治療晚期NSCLC的主要方法[2]。目前臨床上NSCLC常用的化療是以鉑類為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合治療方案，總體藥物反應(yīng)率僅30%～40%，腫瘤耐藥是化療失敗的主要原因。

鉑類藥物主要作用靶點(diǎn)在DNA，損傷DNA的功能，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，對(duì)于鉑類耐藥的腫瘤細(xì)胞，通過誘導(dǎo)凋亡能夠有效逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的耐藥性[3-4]。另外，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)免疫治療聯(lián)合化療的效果優(yōu)于單用化療[5-7]。這些研究通過正向調(diào)節(jié)免疫功能增強(qiáng)了化療效果，提示機(jī)體的不同免疫狀態(tài)能夠影響患者的化療反應(yīng)性。程序性細(xì)胞死亡受體1(programmed cell death 1，PD1)是一種表達(dá)在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和髓系細(xì)胞的免疫抑制受體。PD1與配體PD-L1結(jié)合后可下調(diào)細(xì)胞因子的分泌，導(dǎo)致T細(xì)胞增殖抑制、凋亡、失活，而阻斷PD1信號(hào)能夠使CD8+T細(xì)胞激活，恢復(fù)細(xì)胞毒性能力，從而影響機(jī)體免疫狀態(tài)[8]。張麗萍等[9]對(duì)子宮內(nèi)膜癌的研究發(fā)現(xiàn)，PD1高表達(dá)與患者總生存期延長(zhǎng)相關(guān)。此外，PD1過表達(dá)還能促進(jìn)凋亡，進(jìn)而增強(qiáng)卵巢癌對(duì)順鉑的化療敏感性[10]。因此，PD1單核苷酸多態(tài)性可能造成不同個(gè)體間PD1基因表達(dá)差異，改變PD1受體的結(jié)構(gòu)或功能，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生、發(fā)展，影響化療反應(yīng)性。已有研究發(fā)現(xiàn)PD1單核苷酸多態(tài)性與食管癌[11]、基底細(xì)胞癌[12]、乳腺癌[13]的發(fā)病存在密切關(guān)聯(lián)，但國(guó)內(nèi)外尚未見PD1多態(tài)性與腫瘤化療療效相關(guān)研究報(bào)道。

本研究對(duì)103例采用含鉑方案化療的晚期NSCLC患者的近期療效及化療后骨髓抑制進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并對(duì)PD1基因rs36084323A/G、rs2227982C/T多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析，探討PD1基因多態(tài)性與鉑類藥物化療敏感性及骨髓抑制之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

從2016年5月至2019年3月蘇州科技城醫(yī)院腫瘤科住院患者中收集103例初治晚期NSCLC 患者，所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診?；颊吣挲g30～78歲，平均年齡(56.82±6.08)歲，均為漢族。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)東部腫瘤協(xié)作組評(píng)分≤2分，心電圖無異常，肝腎功能在正常值范圍，骨髓功能正常(白細(xì)胞≥4.0×109/L，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)≥2.0×109/L，血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L，血紅蛋白≥100 g/L)；2)需經(jīng)組織病理學(xué)確診；3)CT掃描證實(shí)具有可測(cè)量評(píng)價(jià)的腫瘤病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)存在第二原發(fā)腫瘤；2)既往曾接受過任何形式的抗腫瘤治療，如手術(shù)、化療、放療等。所有受試者均在完全自愿的基礎(chǔ)上參與本研究，并簽訂知情同意書，本研究經(jīng)蘇州科技城醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 化療方案、臨床療效評(píng)估、毒副反應(yīng)評(píng)價(jià)

103例患者均接受以順鉑(cisplatin, DDP)或卡鉑(carboplatin,CBP)為基礎(chǔ)的化療方案。63例(61.2%)接受DDP/CBP加培美曲塞 (pemetrexed,PEM)，22例(21.3%) 接受DDP/CBP加紫杉醇(paclitaxel, TAX)，18例(17.5%)接受DDP/CBP加吉西他濱(gemcitabine,GEM)治療。化療劑量為:PEM 500 mg/m2，第1天；TAX 135～175 mg/m2，第1天；GEM 1 250 mg/m2，第1、8天；DDP 75 mg/m2，第1天，或CBP取AUC曲線下面積等于5～6，第1天。所有患者均為初治，每3周為1個(gè)化療周期，每化療2個(gè)周期后根據(jù)RECIST1.1實(shí)體瘤療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[14]進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，分為完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、穩(wěn)定(stable disease，SD) 和進(jìn)展(progressive disease，PD)。其中CR、PR 判定為對(duì)鉑類化療敏感；如為SD或PD，則對(duì)鉑類化療不敏感。按WHO化療毒副反應(yīng)分級(jí)[15]將化療后骨髓抑制分為0～Ⅳ度，比較Ⅲ、Ⅳ度骨髓抑制的發(fā)生率在不同基因型患者中的差異。

1.3 DNA 提取和基因型分析

所有103例患者均于首次化療前抽取靜脈血5 mL ，置于抗凝管中，于-20℃下冷凍保存。用DNA快速提純?cè)噭┖?美國(guó)Promega生物試劑公司)提取外周血DNA，并檢測(cè)總的DNA濃度、純度和完整性，顯示樣本濃度適中，適合進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。采用RT-PCR法對(duì)所有受試對(duì)象行PD1基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型檢測(cè)，每個(gè)PCR反應(yīng)體系含1 μL(300 ng)基因組DNA，0.45 μL氯化鎂(50 mM)，0.3 μL引物，1.5 μL PCR緩沖液(10×)，0.45 μL dNTP(10 mM)，1 μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)和10.9 μL無核酸酶水。循環(huán)中的溫度和時(shí)間參數(shù)如下：最初在95℃預(yù)變性5 min，緊接 94℃變性30 s，而后64℃退火30 s，進(jìn)而72℃延伸30 s，共計(jì)行35個(gè)循環(huán)，最后在72℃下延伸5 min。PCR產(chǎn)物3 μL、引物1 μL，與11 μL緩沖液混合，獲得25 μL總體系，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，在95℃變性3 min后立即冰水浴，獲得終產(chǎn)物，按照ABI3100型測(cè)序儀的說明書對(duì)PD1多態(tài)性進(jìn)行測(cè)序，確定基因型。隨機(jī)抽取20%樣本，雙盲法重復(fù)檢測(cè)加以驗(yàn)證，結(jié)果完全一致。各基因位點(diǎn)引物如下，rs36084323上游引物：5，-GCCATCCACAAGGTGGAAGCT，下游引物：5，-CTCAACCCCACTCCCATTCTG；rs2227982上游引物：5，-GGACAGCTCAGGGTAAGCAG，下游引物：5，-GCATACTCCGTCTGCTCAGG。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件統(tǒng)計(jì)，用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)各位點(diǎn)基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡。以χ2檢驗(yàn)或 Fisher精確概率法比較不同基因型對(duì)化療敏感性、骨髓抑制的影響。以比值比(odds ratios,OR)及95%可信區(qū)間(confidence intervals,CI)表示各基因型與治療效果、骨髓抑制的關(guān)系。OR值及95%CI以非條件Logistic回歸模型計(jì)算，并經(jīng)患者年齡、性別、吸煙、組織類型、分化程度等校正。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 化療效果及化療后骨髓抑制

103例晚期NSCLC患者化療后，2例(1.9%)CR，37例(35.9%)PR，28例(27.3%)SD，36例(34.9%)PD?？傮w臨床化療有效率(CR+PR)37.8%?；熀蟪霈F(xiàn)0度骨髓抑制2例(1.9%)，Ⅰ度骨髓抑制40例(38.8%)，Ⅱ度骨髓抑制33例(32.0%)，Ⅲ度骨髓抑制19例(18.4%)，Ⅳ度骨髓抑制9例(8.7%)，其中Ⅲ度及Ⅳ度骨髓抑制累計(jì)28例(27.1%)。DDP/CBP聯(lián)合PEM、DDP/CBP聯(lián)合TAX、DDP/CBP聯(lián)合GEM化療后出現(xiàn)Ⅲ、Ⅳ度骨髓抑制分別有16例(25.4%)、7例(31.8%)、5例(27.8%)，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.337，P=0.845)；不同性別、年齡、病理類型、分化程度、吸煙狀態(tài)、化療方案與化療有效率之間無顯著性關(guān)聯(lián)(P>0.05)?；颊吲R床特征及其與化療反應(yīng)關(guān)系詳情見表1。

2.2 基因型分布

rs36084323及rs2227982多態(tài)性在所有受試者(103例)中均能被明確行基因分型，rs36084323AA、AG、GG基因型分別為41(39.8%)、40(38.8%)及22(21.4%)例；rs2227982CC、CT、TT基因型分別為45(43.6%)、41(39.8%)及17(16.6%)例。 以上2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)各基因型分布均符合群體遺傳學(xué)Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

2.3 基因多態(tài)性與化療敏感性

rs36084323AA、AG、GG基因型患者化療有效率分別為16/41(39.0%)、15/40(37.5%)及8/22(36.3%)，該多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型的化療有效率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

rs2227982CC、CT、TT基因型患者化療有效率分別為9/45(20.0%)、19/41(46.3%)、11/17(64.7%)，CT基因型化療有效率為CC基因型的2.32倍(95%CI:1.185～4.532,χ2=6.779,P=0.009)；TT基因型化療有效率為CC基因型的3.23倍(95%CI:1.636～6.397,χ2=11.28,P=0.001)；至少攜帶一個(gè)T等位基因的患者(CT+TT基因型)化療有效率是CC型的2.58倍(95%CI:1.370～4.880,χ2=10.84,P=0.001)。各位點(diǎn)基因型與化療反應(yīng)關(guān)系、OR值及95%CI見表2。

表1 患者臨床特征與化療反應(yīng)的關(guān)系

表2 各位點(diǎn)基因型分布及與化療反應(yīng)的相關(guān)性

2.4 基因多態(tài)性與化療后骨髓抑制

rs36084323AA、AG、GG基因型患者化療后Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制發(fā)生率分別為5/41(12.2%)、14/40(35.0%)及9/22(40.9%)，AG基因型Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制發(fā)生率為AA基因型的2.87倍(95%CI:1.140～7.227,χ2=5.783,P=0.019)；GG基因型Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制發(fā)生率為AA基因型的3.35倍 (95%CI: 1.281～8.785,χ2=6.570,P=0.013)；至少攜帶一個(gè)G等位基因的患者(AG+GG基因型)Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制發(fā)生率是AA型的3.04倍(95%CI:1.258～7.356,χ2=7.625,P=0.006)。

rs2227982CC、CT、TT基因型患者化療后Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制發(fā)生率分別為12/45(26.6%)、10/41(24.3%)及6/17(35.3%)，該多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型患者的Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各位點(diǎn)基因型與化療后骨髓抑制關(guān)系、OR值及95%CI見表3。

表3 各位點(diǎn)基因型分布及與骨髓抑制的相關(guān)性

3 討 論

目前臨床上治療晚期NSCLC的化療方案仍然是以鉑類藥物為基礎(chǔ)的，例如DDP或CBP聯(lián)合PEM、TAX、GEM等。然而，相同治療方案的化療效果卻因人而異，提示不同個(gè)體之間存在遺傳異質(zhì)性，導(dǎo)致個(gè)體間化療敏感性的差異，因此，根據(jù)患者的遺傳學(xué)特征選擇合理的個(gè)體化治療方案是腫瘤治療的熱點(diǎn)[16]。已有研究證實(shí)促進(jìn)凋亡可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞化療耐藥性[3-4]，而機(jī)體免疫狀態(tài)的改變同樣會(huì)影響化療反應(yīng)性及臨床預(yù)后[5]。因而，免疫調(diào)節(jié)通路、凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑基因多態(tài)性可能與鉑類化療的療效之間存在關(guān)聯(lián)。

PD1基因位于人類染色體2q37.3，基因編碼產(chǎn)物PD1是免疫球蛋白受體超家族成員，PD1有兩個(gè)配體PD-L1及PD-L2，其中PD-L1是主要配體，廣泛表達(dá)于活化的T、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞[17]。PD1與PD-L1結(jié)合后引起PI3K/蛋白激酶B(Akt)及RAS通路去磷酸化，抑制T細(xì)胞活性、誘導(dǎo)凋亡，并促使CD4+T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，對(duì)免疫應(yīng)答進(jìn)行負(fù)向調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的發(fā)生[18]。鐘根深等[6]研究奧沙利鉑對(duì)小鼠結(jié)腸癌的治療效果，在聯(lián)合PD1抗體治療后，抗腫瘤活性較單用奧沙利鉑明顯提升，且發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞在奧沙利鉑的抗腫瘤活性中發(fā)揮重要作用。在另一項(xiàng)動(dòng)物試驗(yàn)中，研究也發(fā)現(xiàn)PD1抗體與紫杉醇聯(lián)合治療能顯著增強(qiáng)小鼠乳腺癌的化療效果[7]。同樣，針對(duì)晚期NSCLC一線治療的KEYNOTE-189研究也顯示，與PEM加DDP/CBP化療組相比，PD1單抗聯(lián)合化療能明顯提升治療反應(yīng)率(47.6%vs18.9%，P<0.001)，并延長(zhǎng)了患者的無進(jìn)展生存期及總生存期[5]。Gadgeel等[19]與Landre等[20]也發(fā)現(xiàn)在化療的同時(shí)進(jìn)行免疫檢查點(diǎn)阻斷，能明顯增強(qiáng)肺癌化療療效。此外，Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)PD1過表達(dá)能促進(jìn)凋亡，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。以上體內(nèi)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均提示PD1及其配體所介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)生異常時(shí)，會(huì)改變機(jī)體的免疫狀態(tài)，影響細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改變化療的反應(yīng)性。因此，我們推測(cè)PD1基因多態(tài)性可能通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)、改變PD1受體的結(jié)構(gòu)或功能，導(dǎo)致個(gè)體間化療敏感性的差異。

rs2227982C/T多態(tài)性位于PD1基因外顯子5，屬于非同義cSNP(Val215Ala)，編碼氨基酸位于PD1受體胞內(nèi)區(qū)，包括免疫受體酪氨酸抑制物基序和免疫受體酪氨酸開關(guān)基序，可能影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而改變PD1在免疫調(diào)節(jié)通路中的作用[21]。Tang等[22]研究了rs2227982多態(tài)性與胃賁門癌的相關(guān)性，相較于CC基因型，TT或TT+CT基因型增加了胃賁門癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。同樣，另一研究也發(fā)現(xiàn)rs2227982多態(tài)性CT基因型增加了女性罹患食管鱗狀細(xì)胞癌(easophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的風(fēng)險(xiǎn)，而攜帶CT基因型且伴吸煙史的食管癌患者預(yù)后較好[11]。然而，至今尚未見PD1多態(tài)性位點(diǎn)與化療反應(yīng)性之間的研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)PD1rs2227982C/T多態(tài)性與晚期NSCLC鉑類化療敏感性存在密切相關(guān)，隨著等位基因T數(shù)目的增加，患者的化療有效率逐漸升高(CC：20.0%、CT：46.3%、 TT：64.7%)。至少攜帶一個(gè)等位基因T的患者化療反應(yīng)率為CC型的2.58倍(95%CI:1.370～4.880，P=0.001)。我們推測(cè)rs2227982多態(tài)性所致核苷酸C-T突變引起編碼的纈氨酸(Val)-丙氨酸(Ala)轉(zhuǎn)換可能影響了PD1分子結(jié)構(gòu)、功能，抑制了PD1的負(fù)向免疫調(diào)控作用，激活T細(xì)胞，減少腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，從而使患者對(duì)鉑類化療具有更好的反應(yīng)性。此外，我們研究了rs2227982C/T多態(tài)性與化療后Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制發(fā)生率之間的關(guān)系，但二者間未見明顯的相關(guān)性(P>0.05)。

PD1另外一個(gè)常見的多態(tài)性位點(diǎn)rs36084323A/G，位于基因啟動(dòng)子區(qū)，涉及UCE-2轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的結(jié)合位點(diǎn)，G等位基因攜帶者具有更高的啟動(dòng)子活性，預(yù)示著T淋巴細(xì)胞的活力下降和增殖抑制，導(dǎo)致清除病毒和癌細(xì)胞的能力較差，但機(jī)體免疫耐受性較好[23]。該多態(tài)性位點(diǎn)與腫瘤的相關(guān)性研究很少，Hua等[13]研究結(jié)果顯示rs36084323GG基因型能降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而另一研究發(fā)現(xiàn)AG基因型能降低有上消化道癌家族史ESCC患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)(HR=0.339，95%CI:0.115～0.996)[11]。

本研究探討了rs36084323A/G多態(tài)性與晚期NSCLC化療臨床反應(yīng)之間的關(guān)系，未發(fā)現(xiàn)不同基因型患者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。但是，我們發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性與化療后Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制之間存在密切關(guān)聯(lián)，隨著等位基因G數(shù)目的增加，患者Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制發(fā)生率逐漸升高(AA：12.2%、AG：35.0%、 GG：40.9%)。至少攜帶一個(gè)G等位基因的患者(AG+GG基因型)Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制發(fā)生率是AA型的3.04倍(95%CI:1.258～7.356，P=0.006)。目前尚未見PD1多態(tài)性與化療毒副反應(yīng)之間關(guān)系的研究報(bào)道，我們推測(cè)rs36084323G等位基因能激活PD1基因啟動(dòng)子，上調(diào)PD1受體的表達(dá)，抑制T淋巴細(xì)胞的活化、增殖，進(jìn)而可能阻礙了化療后淋巴細(xì)胞的生成，加重了化療后骨髓抑制的程度。當(dāng)然，這些結(jié)果還需要該多態(tài)性位點(diǎn)的功能學(xué)研究來進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PD1基因多態(tài)性與晚期NSCLC鉑類化療臨床反應(yīng)、毒副反應(yīng)之間存在關(guān)聯(lián)，攜帶rs2227982T等位基因的患者有更高的化療反應(yīng)率，而rs36084323G等位基因攜帶者更容易出現(xiàn)Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制，該研究結(jié)果可能在提升臨床化療效果、減輕毒副反應(yīng)方面有一定的指導(dǎo)作用。

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