辣木葉高效高壓差低溫連續(xù)式提取工藝優(yōu)化及過程控制指紋圖譜研究

劉常青，段海霞，唐曉純，宋力飛，劉鄉(xiāng)鄉(xiāng)

（廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司，廣東 廣州 510663）

辣木（Moringa oleiferaLam）是辣木科（Moringaceae）、辣木屬（Moringa Adans）植物，又名鼓槌樹，原產(chǎn)于熱帶、南亞熱帶的干旱或半干旱地區(qū)，目前在海南、福建、廣東等南方地區(qū)均有栽培[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，辣木葉的化學(xué)成分主要有黃酮類、多糖類、生物堿類和蛋白質(zhì)等[3]，在降血糖[4-5]、降脂[6]、抗氧化[7]、改善睡眠[8]等方面有顯著效果。其中，黃酮類成分主要有異槲皮苷、沒食子酸、山奈酚、綠原酸等[3]，且含8種人體生命活動(dòng)所需的必需氨基酸[9]。

高效高壓低溫連續(xù)式提取（high performance high pressure and low temperature successive extraction，HHLSE）技術(shù)可在極短的時(shí)間內(nèi)形成-0.1～35 Mpa高壓差并形成高速流，使細(xì)胞完全破碎，可促進(jìn)有效成分的快速溶解，大大提高目標(biāo)成分的提取率。本研究采用HHLSE技術(shù)[10]制備辣木葉提取物，通過正交試驗(yàn)對(duì)HHLSE參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)采用指紋圖譜對(duì)關(guān)鍵點(diǎn)的工藝過程進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，能更直接、更充分地監(jiān)測(cè)工藝過程中目標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移，為辣木葉相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供穩(wěn)定可靠的技術(shù)保證。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效高壓差連續(xù)式低溫提取分離濃縮集成技術(shù)裝備（廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司）；800B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Agilengt1100系列高效液相色譜儀（包括DAD 陣列檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司）；Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；DV215CD 型電子天平（美國(guó)奧豪斯公司）；KQ3200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW135 型中藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）；ZL-I-021手持糖度計(jì)（廣州計(jì)量檢測(cè)技術(shù)研究院）；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（無(wú)錫星海生化設(shè)備有限公司）；GM-0.33A 隔膜真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 材料

辣木葉，產(chǎn)自云南西雙版納，2019年4月采摘；沒食子酸（成都普思生物科技有限公司，純度≥90.1 %，批號(hào)：P80380030）；異槲皮苷（北京儀化通標(biāo)科技有限公司，純度≥98 %，批號(hào)：170526-0373）；乙腈，甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 原藥材前處理

取適量干燥的辣木葉藥材，經(jīng)萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎后過80目篩，保存于陰涼室中，待用。

2.2 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.05 %磷酸（B），梯度洗脫：0～20 min，5 %～10 % A；20～40 min，10 %～28 % A；40～65 min，28 %～50 %A；65～75 min，50 %～100 %A；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為10 μl；體積流量為1.0 ml/min。

2.3 供試品溶液制備

2.3.1 原藥材供試品溶液制備 精密稱取辣木葉粉末4 g，置于50 ml錐形瓶中，加入純化水20 ml，超聲處理30 min（功率500 W，頻率53 kHz），補(bǔ)足減失的重量，過濾，搖勻后取濾液，0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 工藝過程樣品處理 工藝過程中固體樣品按2.3.1項(xiàng)下方法處理，即得；液體樣品經(jīng)真空干燥，1:5純水復(fù)溶，0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 沒食子酸和異槲皮苷對(duì)照品溶液制備

精密稱取沒食子酸對(duì)照品和異槲皮苷對(duì)照品各適量，分別用甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.2523 mg/ml的沒食子酸對(duì)照品溶液和0.2254 mg/ml的異槲皮苷對(duì)照品溶液。

2.5 指標(biāo)性成分的指認(rèn)

采用對(duì)照品對(duì)HPLC指紋圖譜中的各峰進(jìn)行歸屬，結(jié)果見圖1。經(jīng)過對(duì)辣木葉細(xì)碎品和對(duì)照品色譜圖相對(duì)保留時(shí)間和紫外吸收光譜兩項(xiàng)指標(biāo)的比對(duì)，確定了異槲皮苷、沒食子酸為辣木葉中的主要黃酮類活性成分，且含量較高，故將兩者作為指標(biāo)性成分。HPLC指紋圖譜中，沒食子酸的洗脫時(shí)間為8.653 min，異槲皮苷的洗脫時(shí)間為56.2 min。

2.6 不同提取工藝的對(duì)比研究

圖1 辣木葉與對(duì)照品HPLC指紋圖譜匹配圖

2.6.1 熱回流提取 參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]，準(zhǔn)確稱取適量辣木葉粉末，置入500 ml圓底燒瓶，加入200 ml純化水，加熱回流2 h后，冷卻至室溫，收集提取液，4000 r/min離心分離，將所得上清和沉淀物分別按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析。

2.6.2 HHLSE 準(zhǔn)確稱取適量辣木葉細(xì)碎品，按一定的溶劑倍量加入適量純化水，于常溫下進(jìn)行高效高壓提取，提取液經(jīng)4000 r/min分離，將所得上清和沉淀物分別按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析。兩種提取方式所得樣品的HPLC指紋圖譜見圖2。

圖2 2種提取工藝的HPLC指紋圖譜對(duì)比

由圖2可見，兩種提取方式所得離心上清譜圖信息差異較大：熱回流所得離心上清譜圖中的成分種類遠(yuǎn)少于HHLSE，兩種指標(biāo)性成分均被破壞；HHLSE所得離心上清譜圖中的成分種類與辣木葉原料基本一致，且沒食子酸和異槲皮苷兩種成分能得到很大程度的保留。同時(shí)對(duì)比兩種不同工藝的離心沉淀色譜圖，兩者峰型相似，成分種類及含量均遠(yuǎn)少于相對(duì)應(yīng)的離心上清，說明僅有極少部分水溶性成分未被提取出，因此后續(xù)試驗(yàn)可直接舍棄離心沉淀。

2.7 辣木葉HHLSE提取工藝優(yōu)化

2.7.1 辣木葉蛋白質(zhì)提取率測(cè)定 參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]，采用凱氏定氮法測(cè)定辣木葉中蛋白質(zhì)含量：準(zhǔn)確稱取2 g供試?yán)蹦救~粉，平行測(cè)定3份，計(jì)算平均值，同時(shí)吸取空白消化液作為空白。按不同條件提取辣木葉蛋白質(zhì)后，4000 r/min離心15 min，上清采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，按下式計(jì)算蛋白質(zhì)提取率。

提取率（%）=提取液中蛋白含量/辣木葉干粉中粗蛋白含量×100

2.7.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究采用小型均質(zhì)機(jī)模擬高壓差提取器提取過程，簡(jiǎn)便有效地優(yōu)化辣木葉提取條件，為后續(xù)HHLSE提供依據(jù)。選定提取溶劑類型、提取次數(shù)及溶劑倍量[即固液比（g/g），每克藥材使用的提取溶劑總量]作為考察的3個(gè)因素，以蛋白質(zhì)提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（33）正交試驗(yàn)進(jìn)行研究。詳見表1、表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可見，溶劑類型對(duì)辣木葉蛋白質(zhì)的提取率影響最大，提取次數(shù)、溶劑倍量的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)直觀比較并結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果，辣木葉蛋白均質(zhì)提取最優(yōu)條件為：以純化水為溶劑，溶劑倍量30，提取3次，蛋白質(zhì)平均提取率27.9 %。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際并結(jié)合L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果，取藥材量30倍的水，在-0.1～35 Mpa壓差下HHLSE提取3批，蛋白質(zhì)平均提取率為48.56 %，RSD為1.54 %，表明此工藝穩(wěn)定可行。

2.9 辣木葉HHLSE提取濃縮過程指紋圖譜分析

以沒食子酸和異槲皮苷為指標(biāo)性成分，采用HPLC指紋圖譜對(duì)工藝關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。按前期確定的工藝參數(shù)，選定辣木葉原材、離心、微濾、反滲透濃縮、噴霧干燥等關(guān)鍵工序，收集各工序樣品，分別按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析比對(duì)，見圖3、圖4。

圖3 辣木葉原材與提取樣品HPLC指紋圖譜對(duì)比

圖4 辣木葉4個(gè)HHLSE工藝關(guān)鍵點(diǎn)樣品HPLC指紋圖譜對(duì)比

由圖3與圖4可見，藥材中沒食子酸和異槲皮苷這兩種成分能高效轉(zhuǎn)移至最終的噴霧干燥粉中，而離心沉淀、微濾濃液及反滲透濃縮清液中兩種指標(biāo)性成分含量極低，且譜圖信息少，工藝過程可直接舍棄這3部分物料，也充分說明HHLSE組合提取工藝能保留辣木葉大部分有效成分，為辣木相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供可靠的提取工藝。

3 討論

本研究結(jié)果表明HHLSE提取效果優(yōu)于熱回流提??；另結(jié)合均質(zhì)提取正交試驗(yàn)法優(yōu)化HHLSE提取工藝條件，最終確定HHLSE方式最佳工藝條件為：提取溶劑水，溶劑倍數(shù)為30倍，蛋白質(zhì)提取率可達(dá)48.56 %；分析HHLSE提取、過濾濃縮過程中關(guān)鍵控制點(diǎn)的指紋圖譜，表明HHLSE組合提取工藝適用于辣木葉有效成分的提取及保留，可為辣木相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供可靠的提取工藝。