IL-12在血象恢復(fù)領(lǐng)域的非臨床藥效研究進(jìn)展

陳麗娜，王亞俊，莊 婕，丁會(huì)芹*

（1. 康立泰藥業(yè)有限公司，山東 青島 266112；2. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101）

腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一[1-2]，其最基本和最普遍的主要治療方式仍為手術(shù)和放療、化療。但放療和化療在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞造成破壞，引起骨髓抑制及其并發(fā)癥如粒細(xì)胞、血小板減少等[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，白介素-12（inlerleukin-12，IL-12）能通過(guò)保護(hù)骨髓微環(huán)境或刺激其他細(xì)胞因子[4]，誘導(dǎo)長(zhǎng)期造血重建干細(xì)胞增殖并向短期造血重建干細(xì)胞分化、成熟，再分化形成祖細(xì)胞，從而促進(jìn)全血象的恢復(fù)，顯著提高生存率，其效果非常明顯。

國(guó)內(nèi)外均采用小鼠或猴作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用于放療、化療后血象恢復(fù)領(lǐng)域的研究。輻射導(dǎo)致的骨髓抑制較化療更為嚴(yán)重，呈全血象降低，尤以白細(xì)胞和血小板的降低顯著。動(dòng)物各組織器官對(duì)輻射及化療藥物的敏感性不同，骨髓造血系統(tǒng)是最敏感的器官，其次是胃腸道系統(tǒng)。通過(guò)觀察動(dòng)物死亡率、血象指標(biāo)、免疫因子、血象谷值及其出現(xiàn)時(shí)間和持續(xù)時(shí)間等指標(biāo)，評(píng)價(jià)IL-12在血象恢復(fù)和造血重建方面的藥效。

1 重組鼠源IL-12（rmIL-12）的血象恢復(fù)作用

1.1 rmIL-12的輻射防護(hù)效應(yīng)

IL-12有刺激骨髓造血的功能，還能促進(jìn)輻射小鼠的外周血象恢復(fù)，并能延長(zhǎng)全身輻射損傷小鼠的生存期。接受致死劑量輻射的小鼠[5]，于輻射前48，36，24，12 h，及輻射后1，12，24，36 h單次靜脈注射rmIL-12，輻射前24 h和輻射后1 h給予IL-12的小鼠長(zhǎng)期存活率（大于1年）分別為91.4 %和75 %，而對(duì)照組小鼠輻射后25 d內(nèi)全部死亡。評(píng)估照射后小鼠的骨髓病理學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠骨髓的細(xì)胞結(jié)構(gòu)均嚴(yán)重受損，而照射后第12天給藥組小鼠骨髓的造血細(xì)胞集落出現(xiàn)擴(kuò)增，但對(duì)照組無(wú)此現(xiàn)象；第14天給藥組小鼠骨髓細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)至正常水平，而對(duì)照組小鼠骨髓仍然嚴(yán)重?fù)p傷，結(jié)果表明，IL-12有刺激骨髓造血的功能。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)，rmIL-12還能促進(jìn)輻射小鼠的外周血象恢復(fù)。致死劑量（10 Gy）照射后，rmIL-12治療組和對(duì)照組的外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)（peripheral blood cell count，PBCC）在第12天下降至最低點(diǎn)，然后rmIL-12治療組小鼠的PBCC開(kāi)始恢復(fù)，而對(duì)照組小鼠全部死亡；在亞致死劑量（5 Gy）照射組，rmIL-12給藥組顯著減弱了PBCC的降低，并加速了PBCC恢復(fù)。值得注意的發(fā)現(xiàn)是，IL-12促進(jìn)了全血細(xì)胞恢復(fù)，包括白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板。

另一項(xiàng)研究也表明[6]，照射后給予IL-12可延長(zhǎng)全身輻射（total body irradiation，TBI）損傷小鼠的生存期。小鼠經(jīng)8 Gy TBI后24 h和72 h兩次皮下注射10 ng/鼠rmIL-12或安慰劑，實(shí)驗(yàn)組小鼠30 d存活率為87.5 %，而安慰劑組小鼠30 d存活率僅為14 %。其后研究表明，單次注射IL-12也有良好的輻射防護(hù)作用：經(jīng)9 Gy TBI后24，48或72 h單次注射IL-12（30 ng/鼠）均能顯著延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間。與安慰劑組對(duì)比，IL-12給藥后動(dòng)物存活率更高，且照射后24 h比48 h給藥能獲得更高的生存率。安慰劑組與照射后24 h給藥組的存活率有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

不同輻射劑量的研究表明，IL-12增加生存率的作用不受小鼠輻射劑量的影響。受試小鼠接受3個(gè)不同輻射劑量TBI 24 h后，單次注射20 ng/鼠的IL-12均能顯著提高動(dòng)物的存活率。8.6，8.8和9.0 Gy 3個(gè)輻射劑量照射后，安慰劑組的存活率分別為20 %、10 %和0，而給藥組的存活率分別為80 %，60 %和70 %。值得注意的是，增加輻射劑量后單次注射相同劑量的IL-12，小鼠的存活率基本相同，這意味著IL-12的功效并沒(méi)有因?yàn)檩椛鋭┝康脑黾佣档汀?/p>

病理學(xué)分析表明，IL-12能減輕輻射后小鼠骨髓和小腸損傷。經(jīng)8.0 Gy TBI 24 h后使用安慰劑或IL-12，輻射12 d后，安慰劑組小鼠的骨髓幾乎沒(méi)有造血再生跡象，而所有IL-12治療組小鼠骨髓表現(xiàn)出不同程度的造血重建，出現(xiàn)髓系祖細(xì)胞、巨核細(xì)胞和成骨細(xì)胞。以上研究數(shù)據(jù)表明，在免疫系統(tǒng)、骨髓和胃腸道等輻射損傷重疊時(shí)，IL-12對(duì)這3種對(duì)輻射敏感的組織均有緩解作用。

Basile等[7]構(gòu)建了兩種荷瘤小鼠模型，EL4淋巴瘤模型和Lewis肺癌模型，并分別給予放療和化療，研究IL-12對(duì)荷瘤小鼠血象恢復(fù)的作用。放療研究中，對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行137Cs全身照射建模。rmIL-12分預(yù)給藥組、后給藥組及預(yù)-后給藥組，對(duì)照組為安慰劑（PBS）或粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）。中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，淋巴瘤模型中的rmIL-12預(yù)-后給藥組第14天已達(dá)到正常水平，早于其他組。兩種腫瘤模型中，只有IL-12預(yù)-后治療組在早期（第7天）取得了顯著的紅細(xì)胞恢復(fù)效果。血小板計(jì)數(shù)結(jié)果表明，在第21天，所有rmIL-12治療組均表現(xiàn)出顯著的血小板恢復(fù)效果。同時(shí)相對(duì)于G-CSF治療組，第21天所有IL-12治療組產(chǎn)生具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著的血小板恢復(fù)效果?？傊?，無(wú)論淋巴瘤還是肺癌模型，與G-CSF給藥組與對(duì)照組相比，IL-12預(yù)-后分劑量給藥組對(duì)每一種血細(xì)胞的造血恢復(fù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著影響。兩種腫瘤模型的小鼠腫瘤體積測(cè)量結(jié)果表明，IL-12同時(shí)明顯抑制了腫瘤生長(zhǎng)。

1.2 rmIL-12對(duì)化療模型動(dòng)物的血象恢復(fù)作用和聯(lián)合抗腫瘤作用

Basile等[7]向兩種荷瘤小鼠腹腔內(nèi)給予環(huán)磷酰胺建立化療模型。外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，除了淋巴細(xì)胞，兩種腫瘤模型的化療試驗(yàn)均未觀察到明顯的骨髓抑制。但是，兩種腫瘤模型的血細(xì)胞抑制與恢復(fù)情況也有所不同。Lewis肺癌模型中，與安慰劑組相比第4天觀察到rmIL-12預(yù)-后給藥組和后給藥組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著增加。IL-12對(duì)血小板計(jì)數(shù)的影響的差異在兩種腫瘤模型中也均有顯著意義。EL4淋巴瘤模型中，與安慰劑組相比，IL-12后給藥組第8天的血小板計(jì)數(shù)顯著升高；與G-CSF組相比，IL-12后給藥組和預(yù)-后給藥組第8天的血小板計(jì)數(shù)升高也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩種腫瘤模型的化療研究觀察期結(jié)束時(shí)，IL-12聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療使得腫瘤體積顯著減?。?T/C＜50 %），而G-CSF治療均未實(shí)現(xiàn)顯著的腫瘤減少。同時(shí)，化療聯(lián)合IL-12給藥能明顯提高小鼠的無(wú)瘤率，在淋巴瘤試驗(yàn)終止時(shí)，IL-12預(yù)-后給藥組和后給藥組分別有37.5 %和50 %的小鼠無(wú)腫瘤，而安慰劑組未發(fā)現(xiàn)無(wú)腫瘤小鼠。此項(xiàng)結(jié)果表明，IL-12在恢復(fù)造血功能的同時(shí)還表現(xiàn)出與化療藥物協(xié)同抗腫瘤的作用，而G-CSF的抗腫瘤作用卻并不明顯。

2 重組人源IL-12（rhIL-12）的輻射防護(hù)效應(yīng)

2.1 rhIL-12對(duì)放射性輻射恒河猴的輻射防護(hù)效應(yīng)

動(dòng)物研究中[6]，恒河猴經(jīng)6.7 G y T B I（LD50/30）照射，rhIL-12在無(wú)任何支持性治療及抗生素治療情況下分單次或兩次給藥治療，結(jié)果表明，高低劑量rhIL-12單次或兩次給藥皆可降低致死劑量照射引起的死亡率。低劑量單次給藥組的生存率為71 %，其他治療組的存活率為75 %，安慰劑組的存活率是50 %。綜合以上結(jié)果，所有給藥組的存活率75 %，明顯優(yōu)于安慰劑組存活率50 %。

研究進(jìn)一步分析輻照后的血細(xì)胞計(jì)數(shù)變化，12～14 d是血細(xì)胞極期，與對(duì)照組相比，rhIL-12給藥組極期白細(xì)胞數(shù)量、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量及血小板數(shù)量均有顯著提高。同樣有這種明顯趨勢(shì)的還有中性粒細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

對(duì)所有死亡或被安樂(lè)死的受試動(dòng)物進(jìn)行器官病理分析發(fā)現(xiàn)，給藥劑量為100 ng/kg和250 ng/kg動(dòng)物出血發(fā)生率均為12.5 %，安慰劑組的出血率為50 %。

Gluzman-Poltorak等[8]進(jìn)行的一項(xiàng)隨機(jī)雙盲試驗(yàn)中，恒河猴經(jīng)700 cGy TBI后24～25 h皮下注射單劑量的安慰劑（第1組）或劑量分別為50，100，250和500 ng/kg的rhIL-12（第2～5組），在治療過(guò)程中不給予任何抗生素、液體或血液輸注。結(jié)果表明，rhIL-12給藥組能明顯提高輻射動(dòng)物的生存率。即在第60天時(shí)，1～5組的存活率分別是11 %，33 %，39 %，39 %和50 %，所有rhIL-12給藥組和對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，通過(guò)檢測(cè)血小板、平均血小板容積、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，rhIL-12對(duì)造血重建表現(xiàn)出很好的促進(jìn)作用。

上述研究結(jié)果表明，rhIL-12可緩解輻射誘導(dǎo)的骨髓抑制。rhIL-12在減少嚴(yán)重中性粒細(xì)胞減少癥和嚴(yán)重血小板減少癥發(fā)生方面具有顯著作用，同樣淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板及網(wǎng)織紅細(xì)胞的降低程度也相應(yīng)減弱。此外，與對(duì)照組相比，rhIL-12可提高平均血小板容積，表明rhIL-12可促進(jìn)新生血小板從骨髓中釋放。

對(duì)骨髓再生區(qū)域數(shù)量和大小的定量分析同樣支持上述結(jié)論，即單獨(dú)使用rhIL-12即可刺激血細(xì)胞生成，使血液各成分恢復(fù)。rhIL-12給藥組骨髓再生區(qū)域的數(shù)量和面積均比對(duì)照組高，且rhIL-12各給藥組的升高程度較相似。與對(duì)照組相比，這兩個(gè)參數(shù)在500 ng/kg rhIL-12組中顯著升高。

對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行微生物學(xué)和病理學(xué)分析，心臟、腎臟、肝臟、雙肺、腦及脾臟的細(xì)菌學(xué)分析結(jié)果表明，rhIL-12治療組動(dòng)物細(xì)菌生長(zhǎng)比對(duì)照組更少。對(duì)照組血培養(yǎng)細(xì)菌陽(yáng)性率是86 %，rhIL-12給藥組分別為65 %，65 %，47 %和44 %，250及500 ng/kg菌血癥的發(fā)生率明顯少于對(duì)照組（P=0.0072），統(tǒng)計(jì)各組所有器官的出血點(diǎn)及胃腸系統(tǒng)的出血點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的平均出血點(diǎn)均高于各rhIL-12給藥組。

2.2 rhIL-12的輻射防護(hù)作用優(yōu)于G-CSF

一項(xiàng)隨機(jī)盲法試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)[9]，恒河猴經(jīng)700 cGy致死劑量照射后24～25 h，皮下注射rhIL-12（175 ng/kg）可提高動(dòng)物60 d后的存活率（rhIL-12組：56 %，對(duì)照組：36 %）。在對(duì)比研究組中，連續(xù)18 d給予G-CSF（每日10 μg/kg）的給藥組與對(duì)照組相比無(wú)生存率優(yōu)勢(shì)（G-CSF：31 %，對(duì)照組：36 %）。聯(lián)合用藥組單劑量給予rhIL-12并連續(xù)給予G-CSF 18 d后，動(dòng)物的存活率為58 %，和rhIL-12單獨(dú)用藥組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的生存率提高（rhIL-12組：56 %）。

血液學(xué)方面，rhIL-12給藥組極期中性粒細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著提高，嚴(yán)重中性粒細(xì)胞減少癥和嚴(yán)重血小板減少癥的發(fā)生率也顯著減少，而G-CSF組發(fā)生率與對(duì)照組相當(dāng)；G-CSF組動(dòng)物在極期的粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)優(yōu)勢(shì)，且G-CSF對(duì)血小板和網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)改善。結(jié)果表明，rhIL-12單次給藥可促進(jìn)骨髓再生，有恢復(fù)造血的功能，效果優(yōu)于連續(xù)用藥18 d的G-CSF。

骨髓病理評(píng)價(jià)，接受rhIL-12治療的動(dòng)物與對(duì)照組相比，髓細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著增高（P＜0.05），且數(shù)值高于G-CSF組。另外，與對(duì)照組相比，rhIL-12組成熟和不成熟的巨核細(xì)胞增多，尤其是成熟的巨核細(xì)胞更多。

研究分析了各組動(dòng)物的感染、出血、黏膜炎和胃潰瘍情況。IL-12單獨(dú)給藥組和聯(lián)合用藥組與對(duì)照組及G-CSF組相比，感染率更低（rhIL-12組44 %，聯(lián)合用藥組46 %，對(duì)照組61 %，G-CSF組73 %），rhIL-12單獨(dú)給藥組的感染率明顯低于G-CSF組。另外，采用盲法評(píng)估60 d之內(nèi)死亡動(dòng)物的出血得分，rhIL-12單獨(dú)給藥組也低于G-CSF組和對(duì)照組，聯(lián)合用藥組的出血點(diǎn)和對(duì)照組相當(dāng)。與上述結(jié)果類似，胃潰瘍點(diǎn)也是rhIL-12單獨(dú)給藥組為最低，G-CSF組為最高。

此外，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)接受輻射動(dòng)物的存活率與血細(xì)胞谷值密切相關(guān)[10]。非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物照射（700 cGy）后24～25 h，單次皮下注射治療安慰劑（n=64）或rhIL-12（50～500 ng/kg；n=108），或連續(xù)注射G-CSF（每日10 μg/kg，n=26）18 d。血細(xì)胞分析顯示，各組（包括對(duì)照組、IL-12組和G-CSF組）所有幸存動(dòng)物的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血小板的極值中位數(shù)都顯著高于死亡動(dòng)物（P＜0.001）。進(jìn)一步動(dòng)物死亡與血細(xì)胞低谷值（ROC，receiver operating characteristic）曲線分析顯示，淋巴細(xì)胞閾值0.08×109/L是強(qiáng)烈的死亡預(yù)測(cè)信號(hào)。中性粒細(xì)胞和血小板也是死亡預(yù)測(cè)的強(qiáng)烈信號(hào)，而紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞提供較少預(yù)測(cè)生存的信息。而所有動(dòng)物無(wú)論各組單獨(dú)分析或綜合分析，其年齡、性別和體重均與血細(xì)胞極值和存活率無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。這項(xiàng)研究意味著促進(jìn)早期骨髓再生，使所有主要類型的血細(xì)胞谷值增加（尤其淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血小板），可能是rhIL-12減輕輻射導(dǎo)致重度骨髓抑制致死作用的主要機(jī)制。

3 rhIL-12的體外藥效研究

除上述體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)外，還有許多文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)外周血或骨髓血單個(gè)核細(xì)胞集落形成試驗(yàn)，對(duì)IL-12的體外藥效展開(kāi)研究。

研究正常人外周血或骨髓血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)IL-12的體外藥效發(fā)現(xiàn)，在其他細(xì)胞因子如rhIL-3、EPO或G-CSF等存在的情況下，聯(lián)合使用rhIL-12能明顯增加細(xì)胞集落數(shù)[11-12]。Jacobsen等[13]研究表明，集落培養(yǎng)試驗(yàn)中，F(xiàn)MS樣酪氨酸激酶3（FLT3）與IL-12或IL-11聯(lián)合可明顯刺激小鼠骨髓造血祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增。

關(guān)于IL-12刺激造血作用的機(jī)制，有種觀點(diǎn)認(rèn)為IL-12通過(guò)γ干擾素（IFN-γ）發(fā)揮作用。有研究[14]提出IL-12通過(guò)Stat4途徑產(chǎn)生IFN-γ，進(jìn)而作用于造血干細(xì)胞。雖然已普遍認(rèn)為IFN-γ在造血方面有重要作用，但其具體作用機(jī)制目前還不明確，體外研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ對(duì)造血系統(tǒng)存在兩種截然相反的作用：（1）抑制作用。體外試驗(yàn)結(jié)果表明[15]，IFN-γ對(duì)CD34+細(xì)胞的集落培養(yǎng)有明顯的抑制作用，且有劑量關(guān)系。Zoumbos等[16]用健康志愿者和再障患者的骨髓血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行集落培養(yǎng)試驗(yàn)，用IFN-γ抗體處理后，集落數(shù)量明顯增多，尤其是再障患者的骨髓血單核細(xì)胞，從側(cè)面證明IFN-γ對(duì)骨髓造血有抑制作用。（2）促進(jìn)作用。Zhao等[17]用體內(nèi)和體外試驗(yàn)同時(shí)證明了IFN-γ能誘導(dǎo)Lin-Sca-1+C-Kit+（LSK）細(xì)胞的擴(kuò)增。對(duì)野生型小鼠進(jìn)行IFN-γ刺激后，LSK的比例與對(duì)照組相比明顯升高；而IFN-γ受體缺陷型和Stat1缺陷型小鼠，IFN-γ處理組LSK比例無(wú)升高。Caux等[18]采用體外培養(yǎng)試驗(yàn)證明了IFN-γ能增強(qiáng)IL-3對(duì)人CD34+造血祖細(xì)胞的增殖作用。IFN-γ與IL-3聯(lián)合使用，與單獨(dú)使用IL-3相比，CD34+造血祖細(xì)胞的增殖明顯升高。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，IFN-γ聯(lián)合IL-3對(duì)CD34+造血干/祖細(xì)胞有抑制作用，而單獨(dú)使用IL-3則不會(huì)抑制。

結(jié)合早期臨床研究分析認(rèn)為IL-12的毒性與IFN-γ的過(guò)量生成有關(guān)，這意味著IL-12造血作用可能與其劑量有關(guān)，低劑量的IL-12可促進(jìn)造血，而高劑量的IL-12刺激產(chǎn)生過(guò)多的IFN-γ抑制造血，并產(chǎn)生毒性反應(yīng)。同時(shí)，上述文獻(xiàn)中研究結(jié)果的不統(tǒng)一也可能是由使用的試劑不同、試驗(yàn)中添加的生長(zhǎng)因子不同、乃至細(xì)胞不同造成的。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上，國(guó)內(nèi)外研究均證實(shí)IL-12對(duì)重度放射損傷所致全血細(xì)胞減少癥具有很好的治療作用，能刺激骨髓造血早期恢復(fù)，減少出血及感染發(fā)生，并能顯著提高動(dòng)物的生存率[19-22]。我國(guó)癌癥治療壓力逐年加大，放、化療能直接殺傷或控制腫瘤細(xì)胞，因而在臨床上得到廣泛應(yīng)用。但由于放化療特殊的治療方式導(dǎo)致其對(duì)正常組織產(chǎn)生毒性，其中血液學(xué)毒性的發(fā)生率高，經(jīng)常導(dǎo)致患者因造血功能抑制而中斷治療，這種造血功能抑制表現(xiàn)為造血組細(xì)胞及多系血細(xì)胞同時(shí)減少，最為明顯的是粒細(xì)胞和血小板。鑒于IL-12明確的療效、極高的臨床價(jià)值、較低的風(fēng)險(xiǎn)，IL-12藥物的開(kāi)發(fā)對(duì)腫瘤患者放、化療后血細(xì)胞減少的治療具有重大意義，有可能成為打破傳統(tǒng)血象恢復(fù)領(lǐng)域局限性的重磅藥物。