食品中抗生素殘留的預(yù)處理及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

林嫚婷，蘇亞霞，胡漢昆

（武漢大學(xué)中南醫(yī)院（武漢大學(xué)第二臨床學(xué)院），湖北 武漢 430071）

抗生素已被廣泛用于預(yù)防和治療人類(lèi)及動(dòng)物的感染性疾病。但濫用抗生素會(huì)誘使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性,對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用,導(dǎo)致二重感染，從而威脅到人類(lèi)的健康。由于農(nóng)業(yè)的日益發(fā)展和畜牧業(yè)的集約化，大量獸用抗生素被用于預(yù)防和治療動(dòng)物疾病，或是用作動(dòng)物體重增長(zhǎng)促進(jìn)劑[1-2]。而這些動(dòng)物的排泄物、養(yǎng)殖業(yè)的排污等又會(huì)污染土壤和水質(zhì)，導(dǎo)致野生動(dòng)植物體內(nèi)的抗生素累積。此外，有些商戶(hù)會(huì)將抗生素直接添加到食物中，如添加到牛奶中以延長(zhǎng)其新鮮度[3]。如果不加以控制，人類(lèi)長(zhǎng)期低劑量地接觸抗生素很可能會(huì)導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生，并在人群和動(dòng)物群中互相傳遞。

因此，為了最大限度地減少人類(lèi)接觸抗生素，歐、美等國(guó)家的監(jiān)管機(jī)構(gòu)都出臺(tái)了一系列法規(guī)，要求嚴(yán)格控制食物中抗生素的殘留量，這就需要依靠準(zhǔn)確、靈敏的分析方法確定食物中的抗生素類(lèi)別和殘留量。本文對(duì)近年食品中抗生素殘留的前處理及檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，并對(duì)未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)提出展望，以冀為食品中抗生素殘留監(jiān)測(cè)方法的完善提供參考。

1 樣品預(yù)處理技術(shù)

1.1 固相萃?。⊿PE）

SPE是痕量分析中最常用的樣品純化工具之一，它是基于液-固色譜分配原理，通過(guò)選擇性吸附、選擇性洗脫對(duì)樣品中目標(biāo)分析物進(jìn)行分離、純化和富集。該技術(shù)通常是將樣品溶液加載至吸附劑上，保留其中的目標(biāo)分析物，再用適當(dāng)?shù)娜軇┫慈ルs質(zhì)后，用少量不同的溶劑洗脫目標(biāo)分析物，或選用合適的溶劑直接選擇性洗脫目標(biāo)分析物，也可在加載樣品溶液時(shí)，選擇性吸附其中的干擾雜質(zhì)，使目標(biāo)分析物直接流出，從而達(dá)到快速分離、凈化與濃縮的目的。其中，萃取溶劑和固體吸附劑可根據(jù)分析物的不同來(lái)選擇。Hawari等[4]使用以N-丙基乙二胺（PSA）為吸附劑的SPE柱，提取蜂蜜中幾種不同極性的抗生素殘留物（磺胺類(lèi)，四環(huán)素類(lèi)，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)，林可酰胺類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)），發(fā)現(xiàn)甲醇是提取蜂蜜中各種抗生素殘留物最有效的溶劑，分析物的回收率為85 %～111 %。Feng等[5]采用固相萃取技術(shù)提取并測(cè)定了不同蔬菜樣品中的11種抗生素（包括4種磺胺類(lèi)藥物，2種四環(huán)素類(lèi)藥物，3種氟喹諾酮類(lèi)藥物，泰樂(lè)菌素和氯霉素），并比較了Oasis HLB、C18、NH23種SPE柱，結(jié)果表明HLB柱的回收率最高，11種抗生素的平均回收率為71.4 %～104.0 %。該方法凈化效果優(yōu)于液-液萃取，檢測(cè)靈敏度高，但是成本較高，需根據(jù)檢測(cè)目的更換不同的吸附劑，且批次間的重復(fù)性難以保證。

1.2 QuEChERS方法

QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）方法是Anastassiades教授于2003年開(kāi)發(fā)的一種用于快速測(cè)定產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量的樣品前處理技術(shù)[6]，近年在國(guó)際上得到了一致認(rèn)可和廣泛應(yīng)用，其原理與高效液相色譜（HPLC）和SPE相似，都是利用吸附劑與雜質(zhì)的相互作用，選擇性吸附雜質(zhì)從而達(dá)到凈化樣品的目的?；静襟E是先用乙腈提取分離，再用氯化鈉、硫酸鎂鹽析除去樣品中的水和蛋白質(zhì)，然后再添加SPE填料吸附劑除雜，離心得到的上清可直接進(jìn)行檢測(cè)。與傳統(tǒng)的SPE相比較，QuEChERS具有耗時(shí)少、回收率高、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜等植物性食品及蜂蜜、牛奶等動(dòng)物性食品的提取凈化。Wang等[7]采用多種優(yōu)化的QuEChERS方法提取牛奶中的紅霉素、青霉素G、鹽酸四環(huán)素、磺胺甲惡唑、鹽酸環(huán)丙沙星和青霉素V殘留并進(jìn)行測(cè)定，6種抗生素殘留的最大回收率均＞80 %，在最佳預(yù)處理?xiàng)l件下，最大回收率達(dá)84.18 %～115.99 %。Yu等[8]采用QuEChERS方法同時(shí)提取多葉蔬菜中的多種抗生素，結(jié)果表明該法能有效地從葉類(lèi)蔬菜中提取所有目標(biāo)抗生素，20種抗生素的平均回收率為57 %～91 %。雖然QuEChERS方法靈活，但每種抗生物殘留的提取都需進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化（如鹽的類(lèi)型、數(shù)量及吸附劑的體積等），才能得到滿(mǎn)意的回收率。

1.3 基質(zhì)固相分散萃取（MSPD）

MSPD方法是將固體、半固體和黏性樣品與涂漬有C18等多種聚合物的吸附劑材料一起研磨得到半干的均勻混合物，并將其作為填料裝入萃取柱中，然后用不同的溶劑淋洗，將各種目標(biāo)化合物洗脫下來(lái)，目前廣泛應(yīng)用于各種固體和半固體食品中分析物的提取純化。Sun等[9]制備了一系列新型虛擬分子印跡聚合物（DMIP），作為氟喹諾酮類(lèi)的高選擇性吸附劑，并將制備的DMIP應(yīng)用于MSPD，從魚(yú)類(lèi)樣品中選擇性提取8種氟喹諾酮類(lèi)抗生素殘留，回收率為64.4 %～102.7 %。Bogialli等[10]也在分析奶酪中四環(huán)素類(lèi)抗生素殘留的研究中發(fā)現(xiàn)，在MSPD技術(shù)中，熱水是一種有效的萃取劑，其絕對(duì)回收率不低于78 %。該方法省去了傳統(tǒng)樣品前處理中的樣品勻化、組織細(xì)胞裂解、提取、凈化等重復(fù)離心、過(guò)濾、萃取過(guò)程，可直接進(jìn)行提取和凈化，從而縮短整體分析時(shí)間并減少萃取溶劑的消耗，也避免了樣品的損失，但吸附劑目前不可重復(fù)使用。

1.4 加壓液體萃取（PLE）

PLE是在較高的溫度和壓力下用有機(jī)溶劑對(duì)固體或半固體樣品進(jìn)行萃取的自動(dòng)化方法，其中升高的溫度加速萃取動(dòng)力學(xué)，升高的壓力使溶劑的溫度保持在其沸點(diǎn)以下。該方法快速、基質(zhì)影響小、回收率高、重現(xiàn)性好且減少了有毒有機(jī)溶劑的用量。Jiménez[11]等分析雞蛋基質(zhì)中41種抗生素殘留物時(shí)，在70 ℃下用乙腈和琥珀酸緩沖液（pH 6.0）混合溶劑（1:1）進(jìn)行PLE，得到的提取物可直接進(jìn)行色譜分析。但在大部分食品基質(zhì)的預(yù)處理過(guò)程中，PLE后通常還需進(jìn)一步進(jìn)行固相萃取。

1.5 微波輔助萃?。∕AE）

MAE是利用微波能加熱，根據(jù)不同物質(zhì)吸收微波能力的不同將目標(biāo)化合物從樣品中分離出來(lái)的一種新型萃取技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)微波強(qiáng)化，縮短了提取時(shí)間，提高了提取率、降低了成本且減少了溶劑用量，是一種綠色環(huán)保的提取技術(shù)。但采用MAE對(duì)食品基質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，常常需要聯(lián)合SPE等其他技術(shù)才能獲得干凈的提取物。Huang等[12]測(cè)定魚(yú)類(lèi)中6種抗生素殘留時(shí)采用微波輔助萃取-固相純化-分散液相微萃?。∕AE-SPP-DLLME）進(jìn)行分離提純，在最佳條件下，觀察到所有目標(biāo)分析物的良好線(xiàn)性（r＞0.9991）和滿(mǎn)意的回收率（回收率＞87 %），與單純的微波輔助提取和純化相比，該方法觀察到的基質(zhì)效應(yīng)明顯降低。

總之，從食品基質(zhì)中提取抗生素殘留有多種不同方法，但采用什么方法還需根據(jù)具體情況進(jìn)行判斷，不同的食物、不同種類(lèi)的抗生素采用的方法各有不同。若樣本量大且無(wú)需準(zhǔn)確定量，則首要考慮時(shí)間成本，選擇操作簡(jiǎn)便的預(yù)處理方法；若是需要對(duì)各類(lèi)抗生素殘留準(zhǔn)確定量，可能需要聯(lián)用幾種預(yù)處理方法，保證各類(lèi)抗生素殘留的有效提取并去除基質(zhì)效應(yīng)。

2 抗生物殘留的檢測(cè)方法

檢測(cè)食品中抗生素殘留的分析方法可分為兩大類(lèi)，即篩選方法和確證方法。篩選方法是指能檢測(cè)分析物或一類(lèi)分析物的存在并確定其是否符合法規(guī)規(guī)定的方法[13]，可提供定性、半定量或定量結(jié)果，主要用于大量樣本的分析，其理想目標(biāo)是低錯(cuò)誤率、高通量、操作簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、選擇性好、成本低。確證方法則需準(zhǔn)確分析抗生素殘留的種類(lèi)和含量，在定量方面比篩選方法更可靠。目前，篩選方法主要包括薄層色譜法（TLC）、HPLC、毛細(xì)管電泳（CE）、生物傳感器、微生物測(cè)定法和免疫分析法等，確證方法主要為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）。

2.1 TLC

TLC是將支持劑涂布于支持板上作為固定相，配制合適的溶劑作為流動(dòng)相，通過(guò)流動(dòng)相流過(guò)固定相時(shí)產(chǎn)生重復(fù)的吸附、解吸附，對(duì)混合樣品進(jìn)行分離、定性鑒別和定量檢測(cè)的一種層析分離技術(shù)。由于其操作簡(jiǎn)單、適用范圍廣、速度快、成本低，目前已經(jīng)成為最受歡迎和廣泛使用的抗生素篩選方法之一。但仍存在對(duì)于復(fù)雜樣品分離效能較差、靈敏度較小、不易進(jìn)行定量分析等缺點(diǎn)。Ramirez等[14]開(kāi)發(fā)了一種通過(guò)高效薄層色譜（HPTLC）結(jié)合生物自顯影技術(shù)鑒定和定量牛奶中多種抗生素殘留（氯霉素，氨芐西林，芐青霉素，雙氯西林和紅霉素）的分析方法，回收率為90 %～100 %，該方法的靈敏度較好，保證了上述抗生素的檢測(cè)水平低于牛奶允許的最大殘留限量（MRL），且能減少有機(jī)溶劑的使用，大幅降低成本。

2.2 HPLC

HPLC具有“四高一廣”的特點(diǎn)：高壓、高速、高效、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣。除此之外，它所需的樣品量少，測(cè)定精密度高，因此也廣泛應(yīng)用于食品中抗生素殘留的篩選和定量。Guo等[15]采用HPLC（C18柱，215 nm檢測(cè)波長(zhǎng)）同時(shí)測(cè)定牛奶中的克拉維酸和他唑巴坦，均表現(xiàn)出良好的線(xiàn)性（R2＞0.9988），克拉維酸的回收率為81.953 %～87.688 %、RSD為0.975 %～1.248 %，他唑巴坦的回收率為85.007 %～92.991 %、RSD為0.872 %～1.650 %。Khanal等[16]采用快速篩查試劑盒與HPLC分析檢測(cè)了尼泊爾加德滿(mǎn)都谷地鮮奶中的青霉素和磺胺類(lèi)藥物，結(jié)果顯示液相色譜法精確性和準(zhǔn)確性更高，能檢測(cè)出更多的陽(yáng)性樣品。但采用HPLC進(jìn)行多種抗生素殘留的測(cè)定時(shí)還需考慮檢測(cè)器的選擇，以大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素為例，該類(lèi)抗生素的吸收光譜多在紫外末端區(qū)，缺乏特征紫外吸收，不適合采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，而熒光衍生化易導(dǎo)致紅霉素分解，又限制了熒光檢測(cè)器的應(yīng)用。因此，在多種抗生素殘留的分析中，根據(jù)各種抗生素的特征選擇合適的檢測(cè)器對(duì)于建立高靈敏度的分析方法至關(guān)重要。

2.3 CE

近年，CE已被證明是一種強(qiáng)大的分離技術(shù)，通常采用石英作毛細(xì)管柱，通過(guò)施加高壓直流電場(chǎng)，根據(jù)分子在電場(chǎng)中的不同遷移來(lái)達(dá)到分離目的，目前已實(shí)現(xiàn)與HPLC相似的靈敏度、選擇性和特異性。相對(duì)高的效率，快速的分析時(shí)間及溶劑和樣品的低消耗使CE成為環(huán)境友好的檢測(cè)技術(shù)。Dai等[17]建立了一種基于CE和在線(xiàn)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)（CL），使用Ag（III）絡(luò)合物作為氧化劑的食品中磺胺類(lèi)藥物殘留測(cè)定方法，磺胺二甲嘧啶（SDD）、磺胺嘧啶（SDZ）和磺胺噻唑（STZ）的檢出限分別為2.75，3.14，0.65 μg/ml，并成功應(yīng)用于豬肉、雞肉和牛奶樣品中的3種磺胺類(lèi)藥物殘留的同時(shí)測(cè)定。然而，使用CE測(cè)定痕量殘留物的缺點(diǎn)之一，是由于樣品進(jìn)樣體積較小及毛細(xì)管上檢測(cè)的光學(xué)路徑長(zhǎng)度較短，導(dǎo)致其靈敏度較低。

2.4 生物傳感器

生物傳感器是廣泛應(yīng)用于食品安全、疾病檢測(cè)、藥物發(fā)現(xiàn)等多個(gè)領(lǐng)域的一種新方法，由兩個(gè)主要部分組成：生物感受器或生物識(shí)別元件及傳感器，用于識(shí)別目標(biāo)分析物并將識(shí)別事件如分析物濃度轉(zhuǎn)換為可測(cè)量的信號(hào)。主要包括電化學(xué)傳感器、光學(xué)傳感器、重力生物傳感器和熱傳感器。由于其具有特異性高、分析速度快、操作簡(jiǎn)便、高樣品通量且檢測(cè)限符合法規(guī)限制等優(yōu)點(diǎn)，適用于食品中抗生素殘留的篩選。Thompson等[18]開(kāi)發(fā)了一種利用生物傳感器技術(shù)的篩選方法，用于牛、綿羊和豬的腎中酰胺醇類(lèi)抗生素甲砜霉素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺的檢測(cè)，均能檢測(cè)低于其各自1/2 MRL的低濃度。為了達(dá)到理想的生物篩選條件，未來(lái)還需繼續(xù)開(kāi)發(fā)更加高效、經(jīng)濟(jì)的生物傳感器，不僅要提高其靈敏度、特異性，還要結(jié)合納米技術(shù)以?xún)?yōu)化其性能并提供便攜性。

2.5 微生物測(cè)定法

微生物測(cè)定法主要是根據(jù)微生物由于抗生素作用表現(xiàn)出的生理機(jī)能、代謝、抑制程度等變化來(lái)定性、定量地檢測(cè)出樣品內(nèi)的抗生素殘留，具有檢測(cè)可靠性高、操作便捷、成本低的特點(diǎn)，并存在一定的特異性。Tumini等[19]設(shè)計(jì)了一種微生物測(cè)定法，以短小芽孢桿菌孢子包被微量滴定板，通過(guò)觀察其微生物抑制情況檢測(cè)牛奶中四環(huán)素的濃度與MRL，通過(guò)5 h內(nèi)指示劑（亮黑色甲苯胺藍(lán)）顏色的變化，檢測(cè)到117 μg/L金霉素、142 μg/L土霉素和105 μg/L四環(huán)素，顯示出良好的特異性（97.9 %）。但微生物測(cè)定法不能準(zhǔn)確定量，且有些實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果耗時(shí)長(zhǎng)。

2.6 免疫分析法

免疫分析法是基于抗體與抗原或半抗原之間特異性反應(yīng)建立的一種高選擇性生化分析方法，根據(jù)標(biāo)記的不同主要分為熒光免疫分析技術(shù)、放射免疫分析技術(shù)、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)和發(fā)光免疫分析技術(shù)。由于具有高度靈敏性和高度特異性，大大簡(jiǎn)化了測(cè)量過(guò)程，短時(shí)間內(nèi)可檢測(cè)大量樣品，可應(yīng)用于食品抗生素殘留的篩選。Luo等[20]成功開(kāi)發(fā)了一種快速靈敏的化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定法（CLIEA）,用于牛奶中新霉素殘留分析，樣品的平均回收率為88.5 %～105.4 %，檢出限為9.4 μg/kg。不過(guò)，該方法多用于篩選并判斷其是否高于檢測(cè)限，進(jìn)一步定量還需依靠LC或LC-MS來(lái)進(jìn)行，且免疫分析法相對(duì)容易受到干擾，還存在假陽(yáng)性、交叉反應(yīng)性等局限性。

2.7 LC-MS

LC-MS結(jié)合了色譜的高分離效能和質(zhì)譜的定性功能，是迄今為止在任何類(lèi)型的生物基質(zhì)中確認(rèn)抗生素身份的最重要技術(shù)。幾乎所有的抗生素都是極性和/或熱不穩(wěn)定的化合物，因此采用LC比氣相色譜法（GC）更適合。許多國(guó)家的公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)依靠MS檢測(cè)對(duì)食品中的抗生素進(jìn)行確認(rèn)，目前多采用電噴霧電離（ESI）或大氣壓化學(xué)電離（APCI）作為離子源。Shendy等[21]采用LC-MS/MS[四級(jí)桿復(fù)合線(xiàn)性離子阱（QTrap）串聯(lián)質(zhì)譜儀，ESI正離子模式]測(cè)定蜂蜜中的硝基呋喃代謝物和硝基咪唑的殘留量，回收率為90.96 %～104.80 %，重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室再現(xiàn)性的變異系數(shù)（CV）分別為1.35 %～5.10 %和2.65 %～12.58 %，硝基呋喃代謝物的確定限（CCα）和檢測(cè)容量（CCβ）分別為0.12～0.31 μg/kg和0.21～0.53 μg/kg，而硝基咪唑的CCα和CCβ分別為0.53～0.74 μg/kg和0.91～1.27 μg/kg。Dubreil等[22]采用LC-MS/MS（ESI正離子模式）對(duì)肉類(lèi)和水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品中75種抗生素進(jìn)行檢測(cè)，能鑒定出其中的73種抗生素。LC-MS分離效能強(qiáng)、特異性好、靈敏度高，能同時(shí)進(jìn)行定性和定量測(cè)定，是目前比較理想的檢測(cè)手段。

3 展望

食品中抗生素殘留檢測(cè)的難題在于樣品基質(zhì)的復(fù)雜性及檢測(cè)方法的靈敏度，因此目前研究大多集中于如何優(yōu)化樣品提純、凈化的方法及提高檢測(cè)方法靈敏度，但這些方法大多都有其局限性。如何有效地改良優(yōu)化SPE技術(shù)，使之能更好地提純凈化食品基質(zhì)中的抗生素殘留是未來(lái)一大研究方向，研究重點(diǎn)可放在吸附劑材料的開(kāi)發(fā)上。Ye等[23]合成了一種新型的富含氟、硼的吸附劑（FBA），并將其作為磁性固相萃取的萃取相，這種吸附劑不僅具有較強(qiáng)的磁響應(yīng)性和較好的使用壽命，且可與HPLCDAD結(jié)合，對(duì)環(huán)境水和牛奶中的痕量氟喹諾酮類(lèi)抗生素進(jìn)行靈敏的定量。此外，還可開(kāi)發(fā)多功能吸附劑以簡(jiǎn)化萃取步驟、提升萃取質(zhì)量?；|(zhì)固相分散萃取同樣存在吸附劑性能的問(wèn)題，目前已開(kāi)發(fā)出分子印跡聚合物（MIP）、碳納米管-分子印跡聚合物（CNT-MIP）、苯基三氧硅烷-氧化鎂（PTSMgO）、金屬有機(jī)骨架（MOF）等多種新型吸附劑，用于各種復(fù)雜基質(zhì)中的特定化合物提取[24]。Wang等[25]合成了一種新型混合模板分子印跡聚合物，可同時(shí)識(shí)別8種氟喹諾酮類(lèi)、8種磺胺類(lèi)和4種四環(huán)素類(lèi)化合物，回收率達(dá)92 %以上，并用于建立同時(shí)提取豬肉中20種抗生素的基質(zhì)固相分散萃取方法。目前仍迫切需要開(kāi)發(fā)出具有可重復(fù)使用性的吸附劑材料，而磁性納米顆粒是當(dāng)前較有希望的可重復(fù)使用材料，有待深入研究。另外，生物傳感器的應(yīng)用發(fā)展十分迅速，如何提高靈敏度、降低成本、增加便攜性以推廣應(yīng)用也是研究的重點(diǎn)。通過(guò)不斷改進(jìn)生物感受器（生物識(shí)別元件），相信能不斷地促進(jìn)篩選方法的發(fā)展，滿(mǎn)足檢測(cè)需要。而色譜技術(shù)的不斷優(yōu)化和MS技術(shù)的不斷發(fā)展也為痕量分析提供了強(qiáng)有力的幫助，不斷提高食品抗生素殘留的定性定量分析水平。