HPLC法測(cè)定地耳草中槲皮苷和異槲皮苷含量的不確定度評(píng)定

鄧祖磊,洪秋菊,崔 田

(1 蚌埠市食品藥品檢驗(yàn)中心,蚌埠 233000;2 蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系;*通訊作者,E-mail:yinhua625@163.com)

不確定度是評(píng)定測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的評(píng)估參數(shù),體現(xiàn)測(cè)量結(jié)果的可疑程度,反映測(cè)量過(guò)程中對(duì)測(cè)量結(jié)果有影響的隨機(jī)效應(yīng)和系統(tǒng)效應(yīng)[1],在分析測(cè)試中具有重要作用。地耳草藥材為藤黃科植物地耳草(HypericumjaponicumThunb.ex Murray)的干燥全草,具有清熱解毒、利濕消腫、散瘀止痛等功效,用于治療濕熱黃疸、痢疾、泄瀉、急性腎炎、瘡痂癰腫、血吸蟲(chóng)病等[2]?，F(xiàn)代研究表明,地耳草具有抗腫瘤、保肝、抑菌等作用[3],黃酮化合物是其主要活性成分[4],其中槲皮苷及其異構(gòu)體異槲皮苷含量較高[5]。槲皮苷及異槲皮苷可能是地耳草抗腫瘤、保肝的物質(zhì)基礎(chǔ)[6-8],《安徽省飲片炮制規(guī)范》(2005年版)收載有地耳草[9],但該標(biāo)準(zhǔn)較簡(jiǎn)單,僅有性狀和一個(gè)化學(xué)鑒別項(xiàng),不能全面控制藥材質(zhì)量,參考文獻(xiàn)[10]建立地耳草中槲皮苷、異槲皮苷的HPLC法測(cè)定含量,同時(shí)參考《藥品檢測(cè)結(jié)果不確定度指導(dǎo)原則(中國(guó)藥典2020年版第二次征求意見(jiàn)稿)》、《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[11]及相關(guān)文獻(xiàn)[12-16],對(duì)已建立的地耳草中槲皮苷和異槲皮苷含量測(cè)定HPLC法進(jìn)行不確定度分析及評(píng)定,為測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司,配有四元梯度泵、DAD檢測(cè)器和Agilent chemstation數(shù)據(jù)系統(tǒng));C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm;月旭科技(上海)股份有限公司)、BS210S電子天平(德國(guó)賽多利斯儀器有限公司)、CP225D電子天平(德國(guó)賽多利斯儀器有限公司)、BGZ-246電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 藥品與試劑

槲皮苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):111538-201105,純度:92.7%)、異槲皮苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):111809-201403,純度:92.9%)、乙腈(色譜純,美國(guó)天地有限公司,批號(hào):13045013)、甲醇(色譜純,美國(guó)天地有限公司,批號(hào):14090484)、冰醋酸(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、超純水。地耳草(來(lái)源:亳州三義堂藥業(yè)有限公司;批號(hào):20151102;產(chǎn)地:江西)由蚌埠市食品藥品檢驗(yàn)中心副主任中藥師崔田鑒定為藤黃科植物地耳草(HypericumjaponicumThunb.ex Murray)的全草。留樣憑證標(biāo)本存于蚌埠市食品藥品檢驗(yàn)中心標(biāo)本室。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜條件:色譜柱為月旭C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈-2.5%冰醋酸(19 ∶81);檢測(cè)波長(zhǎng)355 nm。進(jìn)樣量10μl。

系統(tǒng)適用性:二者理論板數(shù)均大于3 000,分離度大于1.5,符合藥典要求。

1.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取槲皮苷23 mg、異槲皮苷對(duì)照品12 mg,分別置20 ml容量瓶中,用80%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品貯備液。分別吸取槲皮苷、異槲皮苷對(duì)照品貯備液1.0 ml,置20 ml容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得對(duì)照品溶液。

1.3.3 供試品溶液制備 取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入50 ml 80%甲醇,稱(chēng)定質(zhì)量,加熱回流1 h,放冷,再稱(chēng)定質(zhì)量,用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)學(xué)模型建立與不確定度來(lái)源分析

按外標(biāo)法建立槲皮苷、異槲皮苷含量測(cè)定公式:

式中MR:對(duì)照品稱(chēng)樣量;η:對(duì)照品純度;AR:對(duì)照品峰面積;M0:稱(chēng)量瓶的質(zhì)量;M1:烘干前的樣品與稱(chēng)量瓶的質(zhì)量;M2:烘干后的樣品與稱(chēng)量瓶的質(zhì)量;MS:供試品稱(chēng)樣量。

根據(jù)上述公式,可以分析得出,含量測(cè)定的不確定度來(lái)源于對(duì)照品的純度及稱(chēng)樣量、烘干前后的樣品與稱(chēng)量瓶的質(zhì)量、稱(chēng)量瓶的質(zhì)量、對(duì)照品及供試品稀釋體積、對(duì)照品及供試品色譜圖中同一成分的峰面積。此外,供試品和對(duì)照品峰面積的重復(fù)性等也是不確定度的來(lái)源。

由上述分析將槲皮苷及異槲皮苷含量測(cè)定的相對(duì)不確定度表達(dá)為:

2.2 不確定度各分量的評(píng)定

2.2.6 對(duì)照品色譜峰引入的不確定度μrel(AR)精密稱(chēng)取對(duì)照品1份,平行進(jìn)樣5次,記錄色譜圖(見(jiàn)圖1)。槲皮苷5次色譜峰面積分別為2 075.30,2 061.50,2 065.31,2 060.26,2 079.63,異槲皮苷5次色譜峰峰面積分別為1 157.70,1 145.00,1 151.30,1 150.23,1 152.23,平均峰面積分別為As1=2 068.40和As2=1 151.35。采用極差法計(jì)算,極差分別為Rq=19.37和Riq=12.7。當(dāng)n=5時(shí),極差系數(shù)2.33。槲皮苷與異槲皮苷對(duì)照品色譜峰峰面積引入的相對(duì)不確定度分別為:

圖1 對(duì)照品溶液槲皮苷、異槲皮苷色譜圖Figure 1 Chromatogram of reference solutions of isoquercitrin,quercitrin

2.2.7 供試品色譜峰引入的不確定度μrel(AS)采用雙樣平行法測(cè)定,每份供試品溶液進(jìn)樣2次,色譜圖見(jiàn)圖2。供試品溶液1的槲皮苷、異槲皮苷色譜峰峰面積分別為1 403.50,1 401.90,722.30,717.20。供試品1中槲皮苷、異槲皮苷的極差分別為Rq1=1.6和Riq1=5.1,平均值分別為1 402.70和719.75。供試品溶液2的槲皮苷、異槲皮苷色譜峰峰面積分別為1 377.20,1 375.10,712.80和706.20,兩者的極差值分別為Rq2=2.1和Riq2=6.6,平均峰面積分別為1 376.15和709.50。采用極差法計(jì)算[1],當(dāng)n=2時(shí),極差系數(shù)C=1.33,槲皮苷與異槲皮苷對(duì)照品色譜峰峰面積引入的相對(duì)不確定度分別為:

圖2 供試品溶液色譜圖Figure 2 Chromatogram of sample solution of Hypericum japonicum Thunb.ex Murray

供試品引入的相對(duì)不確定度分別為:

2.3 不確定度各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度統(tǒng)計(jì)與標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度擴(kuò)展不確定度的計(jì)算

不確定度各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1,2。

表1 槲皮苷的相對(duì)不確定度各分量表Table 1 Relative uncertainty of each component for quercitrin

表2 異槲皮苷的相對(duì)不確定度各分量表Table 2 Relative uncertainty of each component for isoquercitrin

根據(jù)上述計(jì)算結(jié)果,按公式③計(jì)算槲皮苷、異槲皮苷的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:

實(shí)驗(yàn)中,按外標(biāo)法計(jì)算,該批地耳草樣品的槲皮苷和異槲皮苷含量分別0.40%和0.39%,因此,槲皮苷和異槲皮苷的合成不確定度分別為:μq=0.40%×6.32×10-2=2.53×10-4,μiq=0.39%×1.17×10-1=4.56×10-4。選擇包含因子k=2,置信概率為95%時(shí)[15],則槲皮苷、異槲皮苷的擴(kuò)展不確定度分別為Uq=2×2.53×10-4=5.06×10-4,Uiq=2×4.56×10-4=9.12×10-4。因此,地耳草中槲皮苷和異槲皮苷的含量測(cè)定結(jié)果分別為(0.40±0.05)%和(0.39±0.09)%,k=2。

3 討論

從相對(duì)不確定度分量表1,2中可以看出,地耳草中槲皮苷含量測(cè)定不確定度的主要來(lái)源于對(duì)照品稱(chēng)量,高效液相色譜儀和對(duì)照品、樣品溶液的稀釋對(duì)不確定度貢獻(xiàn)也較大,異槲皮苷含量測(cè)定不確定度的主要來(lái)源與槲皮苷類(lèi)似,但供試品峰面積對(duì)其不確定度貢獻(xiàn)也較大,而對(duì)照品純度和水分對(duì)二者不確定度貢獻(xiàn)相對(duì)較小。

不確定度評(píng)定結(jié)果提示在實(shí)際檢驗(yàn)操作過(guò)程中,首先要保證實(shí)驗(yàn)儀器、計(jì)量器具等均應(yīng)計(jì)量檢定合格,并注意維護(hù)和保養(yǎng),對(duì)照品稱(chēng)量應(yīng)選擇合適量程及精度的電子分析天平,以提高稱(chēng)量的靈敏度和準(zhǔn)確性;其次在實(shí)驗(yàn)時(shí)適當(dāng)增加對(duì)照品的取樣量、稀釋過(guò)程盡可能選用體積相對(duì)較大的量具并盡可能減少稀釋步驟,增加平行樣測(cè)定,也可以適當(dāng)減少不確定度分量所占的比重。