響應(yīng)面法優(yōu)化紫花地丁總酚酸的提取工藝及其抗氧化活性研究

段建榮,嚴(yán)貴亮,楊 輝

(1 張家口市沙嶺子醫(yī)院藥劑科,張家口 075000;2 河北北方學(xué)院藥學(xué)系;*通訊作者,E-mail:yangkcer@163.com)

紫花地丁(Violaphilippica)為堇菜科多年生草本植物,又名野堇菜、光瓣堇菜等[1],味苦、性寒,具有清熱解毒的功效,是一種藥食同源的植物,在民間用藥歷史悠久。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,紫花地丁具有抗炎、抑菌、抗病毒和抗腫瘤等多種功效[2]。文獻(xiàn)報(bào)道紫花地丁含有豐富的有機(jī)酸類成分[3]。酚酸是有機(jī)酸中一類具有多重藥理活性的天然多酚類化合物,近年來可見較多針對植物總酚酸藥理作用的報(bào)道,發(fā)現(xiàn)其具有多方面的藥理活性[4-6],但目前對于紫花地丁中總酚酸的研究報(bào)道較少。

本研究采用Box-Behnken法研究紫花地丁總酚酸的提取工藝,清除DPPH自由基法測定紫花地丁總酚酸抗氧化活性,以期為紫花地丁在臨床上的應(yīng)用及開發(fā)提供理論參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

紫花地丁(河北崇禮,經(jīng)張家口學(xué)院韓博老師鑒定為紫花地丁Violaphilippica全草);沒食子酸對照品(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);1,1-二苯基-2-苦基肼[1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl,DPPH,純度≥98%,上海賽抑生物科技有限公司];其余試劑為分析純。

1.2 儀器

Alpha-1900雙光束掃描型紫外可見分光光度計(jì)(上海譜元儀器有限公司);萬分之一電子分析天平(賽多利斯公司);PHS-3C數(shù)字酸度計(jì)(上海大普儀器有限公司);QL-901渦旋混合器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫花地丁總酚酸供試液的制備

取紫花地丁全草適量,60 ℃干燥至恒重。精密稱取干燥后的紫花地丁粗粉1 g,加入65%乙醇,液料比(ml/g)為10 ∶1,浸泡30 min,加熱回流2次,每次1 h,合并兩次提取液,過濾,取濾液,置50 ml量瓶中,加65%乙醇定容即得[7]。

2.2 對照品貯備液的制備

精密稱取沒食子酸對照品0.011 g,置100 ml棕色量瓶中,加65%乙醇溶解并定容,得沒食子酸貯備液(0.110 0 mg/ml)。

2.3 紫外吸收波長的測定

分別吸取沒食子酸對照品貯備液、紫花地丁總酚酸提取溶液各1ml,于25 ml容量瓶中,加無水乙醇4 ml,加2 ml 0.3%十二烷基磺酸鈉(SDS),加2 ml 1% FeCl3-0.5%鐵氰化鉀(1 ∶1)混合液,避光靜置5 min,加0.1 mol/ml HCl至刻度,混勻,避光反應(yīng)。20 min后以66%乙醇加顯色劑為參比液進(jìn)行基線校正,于波長200-800 nm處掃描[8]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在754 nm處樣品和與對照品均有最大吸收,且顯色前,兩者在該波長下無吸收,提示紫花地丁提取物溶液所含成分不會干擾總酚酸的含量測定,故確定754 nm為測定波長。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別取對照品貯備液0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0 ml于25 ml容量瓶中,按“2.3紫外吸收波長的測定”項(xiàng)下方法顯色,并測定吸光度。以沒食子酸的濃度(C)為橫坐標(biāo),以吸光度(A)為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=101.34C+0.002 1,R2=0.999 4,結(jié)果表明,沒食子酸在0-0.008 8 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取對照品溶液適量,按“2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下方法測定吸光度,重復(fù)測定5次,結(jié)果吸光度RSD為2.56%(n=5)。表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液適量,每隔25 min測定一次,結(jié)果吸光度RSD為3.74%(n=5)。表明樣品溶液顯色后在100 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取紫花地丁粗粉6份,各1 g,按“2.1紫花地丁總酚酸的供試液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下方法測定吸光度,結(jié)果吸光度RSD為2.82%(n=6)。表明重復(fù)性試驗(yàn)良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的紫花地丁粗粉3份,各0.500 g,分別精密加入沒食子酸貯備液0.5 ml,按“2.1紫花地丁總酚酸的供試液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下方法測定吸光度,結(jié)果平均回收率為100.81%,RSD為2.97%。

2.9 單因素實(shí)驗(yàn)

分別對乙醇濃度、回流時間和液料比進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),確定各因素的適宜取值范圍,從而選擇響應(yīng)面的設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素水平范圍[9]。

2.9.1 乙醇濃度的考察 按2.1方法提取紫花地丁總酚酸,固定提取時間為1 h,回流提取2次,液料比(ml/g)為10 ∶1,選擇35%,45%,55%,65%,75%,85%,95%乙醇,每個濃度重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),考察乙醇濃度對提取液吸光度的影響。圖1結(jié)果顯示,提取液平均吸光度隨乙醇濃度增加先增大后減小,當(dāng)乙醇濃度為65%時,所得提取液吸光度最大[10]。

圖1 乙醇濃度對提取液吸光度的影響Figure 1 Effect of the ethanol concentration on the absorbance of exteaction solition

2.9.2 回流時間的考察 以60%乙醇為溶劑,液料比(ml/g)為10 ∶1,回流提取2次,分別選擇1 h,1.5 h,2 h,2.5 h,3 h,3.5 h作為提取時間,每個提取時間重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),考察提取時間對提取液吸光度的影響。結(jié)果可見提取液平均吸光度隨回流時間的延長而增大,當(dāng)回流時間為2 h時,所得提取液吸光度最大(見圖2)[11]。

圖2 回流時間對提取液吸光度的影響Figure 2 Effect of the reflux time on the absorbance of exteaction solition

2.9.3 液料比的考察 以濃度為65%的乙醇溶劑,液料比(ml/g)分別為10 ∶1,20 ∶1,30 ∶1,40 ∶1,50 ∶1,回流提取2次,每個液料比重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),考察不同液料比對提取液吸光度的影響。結(jié)果可見提取液平均吸光度隨提取溶劑比例的增加先增大后減小,當(dāng)液料比為30 ∶1時,所得提取液吸光度最大(見圖3)[12]。

圖3 液料比對提取液吸光度的影響Figure 3 Effect of the ratio of liquid to material on the absorbance of exteaction solition

2.9.4 提取率的計(jì)算 將測得的吸光值代入回歸方程中計(jì)算總酚酸質(zhì)量濃度,再計(jì)算出總酚酸的提取率[13]?？偡铀岬寐使?R1=C×V×N/W×100%。

式中:R1表示紫花地丁總酚酸的提取率(mg/g);C表示由回歸方程計(jì)算出的樣液中總酚酸濃度(mg/ml);V表示提取液體積(ml);N表示稀釋倍數(shù);W表示紫花地丁的質(zhì)量(g)。

2.10 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案,以乙醇濃度A、提取時間B、液料比C為考察因素,以紫花地丁總酚酸提取率為響應(yīng)值,利用Design-Expert v8.0.6軟件優(yōu)化紫花地丁總酚酸提取工藝。試驗(yàn)因素、水平編碼見表1。設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2,擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析見表3。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface design

對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得紫花地丁總酚酸提取率對自變量乙醇濃度A、提取時間B、液料比C的二次多項(xiàng)回歸方程為:

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

R1=+0.70+0.024A+0.016B-0.020C-0.041AB+6.500×10-3AC-0.015BC-0.087A2-0.054B2-0.091C2。

由表3中的P值可以知道,方程中A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2對Y值的影響顯著,表明實(shí)驗(yàn)因子對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。由回歸方程可知因素A與B,A與C及B與C均有交互作用。其回歸方程響應(yīng)面及等高線見圖4-6,各交互因素的響應(yīng)面存在最高點(diǎn),即在所選的范圍內(nèi)存在極值,說明各因素考察范圍較為適當(dāng)。

圖4 乙醇濃度和提取時間對紫花地丁總酚酸提取率的響應(yīng)面圖Figure 4 The contour map and response surface graph of effect of ethanol concentration and reflux time on extraction yield of total phenolic acids

表3 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 3 ANOVA for the fitted quadratic polynomial model

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,紫花地丁總酚酸的最佳提取工藝為:乙醇濃度66.06%,液料比33.84 ml/g,回流提取兩次,每次時間122.40 min,在此條件下預(yù)測紫花地丁總酚酸的提取率為7.04 mg/g藥材。為實(shí)驗(yàn)方便,最終確定,紫花地丁總酚酸提取工藝為乙醇濃度66%,液料比34 ml/g,回流提取兩次,每次時間120 min。

圖5 液料比和乙醇濃度對紫花地丁總酚酸提取率的響應(yīng)面圖Figure 5 The contour map and response surface graph of effect ratio of liquid to material and ethanol concentration on extraction yield of total phenolic acids

圖6 液料比和提取時間對紫花地丁總酚酸提取率的響應(yīng)面圖Figure 6 The contour map and response surface graph of effect of ratio of liquid to material and reflux time on extraction yield of total phenolic acids

2.11 樣品的測定

精密稱取脫脂紫花地丁粗粉6份,各1 g,按照響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝,制備提取液,顯色并測定吸光度,計(jì)算紫花地丁中總酚酸的含量。總酚酸含量分別為7.05,7.01,7.03,7.06,7.02,7.03 mg/g,平均(7.033±0.014 4)mg/g,RSD=0.265%。

2.12 紫花地丁總酚酸對DPPH自由基的清除率

參照文獻(xiàn)[15]的方法,分別吸取適量總酚酸提取液,配制成濃度為0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/ml的待測溶液。分別吸取2 ml待測溶液,與2 ml質(zhì)量濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液于試管中混勻,室溫下在暗處靜置30 min后,以維生素C為陽性對照,以無水乙醇作為參比,在517 nm處測定吸光度,用下式計(jì)算DPPH自由基抑制率(I):

I=(A0-Ae)/A0×100%。

式中:A0為不加樣品的空白吸光度,Ae為加樣品后的吸光度。

結(jié)果可知,在0.1-0.5 mg/ml的范圍內(nèi),紫花地丁總酚酸溶液的DPPH自由基清除能力與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān),但均小于80%(見圖7)。當(dāng)總酚酸溶液濃度為0.5 mg/ml時清除率為76.11%,達(dá)到最高,其對DPPH自由基的半數(shù)清除濃度IC50值為0.254 mg/ml,維生素C酸對DPPH自由基的半數(shù)清除濃度IC50值為0.077 mg/ml,說明紫花地丁總酚酸溶液在相同濃度下,對DPPH自由基的清除能力弱于維生素C。

圖7 紫花地丁總酚酸及維生素C對DPPH自由基的清除率Figure 7 DPPH free radical scavenging rate of total phenolic acids from Viola philippica and Vc

3 討論和結(jié)論

本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化紫花地丁活性成分總酚酸的提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,乙醇濃度、提取溫度、液料比及乙醇濃度、提取溫度、液料比平方項(xiàng)對紫花地丁總酚酸提取率的影響顯著,并且,各考察因素之間均有交互作用。說明乙醇濃度、提取溫度、液料比對紫花地丁總酚酸提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。以濃度為66%的乙醇,按照液料比34 ml/g,回流提取兩次,每次時間120 min為最佳提取工藝,在此條件下,提取的紫花地丁總酚酸的含量為7.033 mg/g,基本與預(yù)測含量相吻合。

該提取方法簡便易行,穩(wěn)定可靠,重現(xiàn)性好,可作為紫花地丁總酚酸的提取方法,為紫花地丁作為新藥的開發(fā)及應(yīng)用于臨床提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

紫花地丁總酚酸提取液對DPPH自由基的半數(shù)清除濃度IC50值為0.254 mg/ml,當(dāng)濃度達(dá)到0.5 mg/ml時,對DPPH自由基的清除率接近維生素C的清除率,表明紫花地丁總酚酸提取液具有較好的抗氧化活性,可以為紫花地丁酚酸類化合物的探索研究及進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù),說明紫花地丁具有一定的開發(fā)價值并可能產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)效益。