基于納米磷脂盤(pán)包被CD44v6的特異性多肽篩選

張 丹,盧桂芳,馮 云,劉亞萍,趙 倩,任牡丹,盧新蘭,和水祥

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:dyyyjxk@xjtu.edu.cn)

篩選腫瘤標(biāo)志物的特異性配體是實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向診斷以及治療的重要措施。目前針對(duì)腫瘤分子影像的顯像方法如PETCT/SPETCT、光學(xué)成像、MR和超聲等平臺(tái)的研究已獲得重大的突破,但開(kāi)發(fā)獲取高靈敏性、特異性、親和力的分子探針,是這項(xiàng)研究的難點(diǎn)與重點(diǎn)[1,2]。CD44是比較重要的腫瘤標(biāo)志物,針對(duì)該蛋白的靶向藥物開(kāi)發(fā)已有報(bào)道。CD44v6是CD44中腫瘤特異性、靈敏性均較高的結(jié)構(gòu)域。曾有針對(duì)此結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體藥物進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段,但因致死性副反應(yīng)被中斷試驗(yàn)[3]。相對(duì)于抗體類(lèi)配體,多肽配體具有更小的分子量,因此免疫原性及毒性也相對(duì)較低[1],因此本研究致力于開(kāi)發(fā)此類(lèi)配體。而目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)針對(duì)CD44v6的配體多肽報(bào)道。

噬菌體展示肽庫(kù)是獲得特異性親和多肽的高通量篩選方法。本課題組前期使用噬菌體多肽展示技術(shù)分別篩選了重組蛋白、細(xì)胞、癌組織,結(jié)果表明利用細(xì)胞、組織篩選的多肽藥物具體靶點(diǎn)分子不易明確,蛋白篩選的過(guò)程中其高級(jí)結(jié)構(gòu)及活性形式難以保持,影響探針的親和力及特異性[4-7]。而近來(lái)出現(xiàn)的納米磷脂盤(pán)技術(shù)可以在體外模擬膜蛋白在細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)中的活性結(jié)構(gòu)[8]。本研究對(duì)CD44蛋白進(jìn)行Nanodisc包被,改良傳統(tǒng)噬菌體展示肽庫(kù)篩選方法,篩選并驗(yàn)證了CD44v6特異性配體多肽序列。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

人胃癌SGC-7901細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)),人胚腎HEK-293細(xì)胞(美國(guó)菌種保藏中心)。真核來(lái)源的CD44v3-v10重組蛋白(OriGene,美國(guó)),噬菌體展示12肽庫(kù)(New England Biolabs,美國(guó)),His-MSP蛋白(Cube Biotech,德國(guó)),抗CD44v6單克隆抗體(北京鼎國(guó)昌盛公司),抗M13噬菌體抗衣殼蛋白多克隆抗體(Santa Cruz,美國(guó)),HRP標(biāo)記兔抗山羊抗體(北京博奧森公司),TMB顯色試劑盒(北京博奧森公司)。

1.2 CD44v3-v10蛋白的Nanodiscs組裝及檢測(cè)

將137 μl的100 mmol/L膽酸鈉溶液(溶于20 mmol/L Tris，pH 7.4)與4.65 mg二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)混合，37 ℃搖動(dòng)孵育30 min。將His-MSP蛋白溶于ddH2O中(2 mg/ml,W/V)，CD44v3-v10蛋白(2 mg/ml,W/V)溶于緩沖液20 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl(pH 7.4)，與等體積100 mmol/L膽酸鈉混合。500 μl混合物與DMPC溶液混合，4 ℃、37 ℃交替孵育，每次20 min，共孵育2 h。使用3-8 kD孔徑透析管4 ℃透析48 h，期間更換透析液4次。

采用分子排阻色譜鑒定,色譜柱為SuperdexTM200 Increase 10/300 GL分子排阻預(yù)裝柱(GE,美國(guó)),流動(dòng)相為50 mmol/L磷酸鹽緩沖液含0.15 mol/L NaCl(pH 7.0),流速0.5 ml/min,上樣量25 μl。

采用SDS-PAGE檢測(cè),25 μl樣品與5 μl 6×SDS-PAGE上樣緩沖液混合,煮沸5 min,加入10%分離膠與5%濃縮膠所制膠板,SDS-PAGE分離蛋白,考馬斯亮藍(lán)染色。

1.3 噬菌體展示肽庫(kù)篩選

陰性篩選：1% BSA(W/V)溶于0.84% NaHCO3(W/V，pH 8.4)，4 ℃過(guò)夜，包被至酶標(biāo)板，3% BSA(W/V)封阻滿(mǎn)孔2 h。將10 μl噬菌體展示肽庫(kù)使用TBS(10 mmol/L Tris，pH 7.4)稀釋至100 μl，加入陰性篩選孔，37 ℃搖動(dòng)孵育2 h。

陽(yáng)性篩選：將陰性篩選后未結(jié)合噬菌體上清與100 μl Nanodiscs包被CD44v3-v10蛋白混合，加入TBS溶1% BSA(W/V)以及Ni-NTA磁珠(Cube Biotech，德國(guó))，37 ℃搖動(dòng)孵育2 h。去除未結(jié)合噬菌體上清，0.1% TBST(Tween-20 0.1%,W/V)洗滌磁珠6次。磁珠使用單克隆抗CD44v6抗體(15 mg/ml)競(jìng)爭(zhēng)性洗脫30 min，收集洗脫液。

滴定:將待滴定文庫(kù)使用LB液體培養(yǎng)基分別稀釋10-6,10-7,10-8,10-9,10-10稀釋度,分別加入培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期E.coli ER2738菌液中,混勻后加入3 ml頂層瓊脂糖中,迅速混勻倒至LB/IPTG/Xgal固體培養(yǎng)基平板,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,選擇含有102數(shù)量級(jí)藍(lán)色噬菌斑的平板計(jì)數(shù),噬菌體滴度=(噬菌斑數(shù)目×稀釋倍數(shù))pfu/10 μl。計(jì)算回收率:回收率=回收噬菌體/投入噬菌體。

擴(kuò)增:將陽(yáng)性篩選后全部洗脫液加至20 ml對(duì)數(shù)期E.coliER2738菌液中,37 ℃、225 r/min振蕩培養(yǎng)4.5 h,將培養(yǎng)物離心,每毫升上清中加入200 μl PEG/NaCl沉淀噬菌體,TBS重懸,重復(fù)上述沉淀-重懸過(guò)程,加入200 μl TBS/0.02%NaN3(W/V)噬菌體保存液,是為次級(jí)庫(kù)。對(duì)次級(jí)庫(kù)進(jìn)行滴定。

后續(xù)篩選:重復(fù)以上過(guò)程進(jìn)行后續(xù)篩選,每輪投入噬菌體為上輪篩選所得次級(jí)庫(kù),洗滌步驟中TBST根據(jù)篩選輪次分別為0.2%,0.3%及0.5%,第四輪篩選洗脫液滴定后不再擴(kuò)增。

1.4 噬菌體測(cè)序

分別從第4輪篩選洗脫物滴定平板隨機(jī)挑取30個(gè)噬菌體單克隆,分別加入3 ml對(duì)數(shù)期E.coliER2738菌液,37 ℃、225 r/min振蕩培養(yǎng)4.5 h,將培養(yǎng)物10 000 r/min離心10 min,收取上清,命名為噬菌體單克隆貯液。在貯液500 μl中加入200 μl PEG/NaCl,4 ℃沉淀噬菌體,去除上清,使用碘化物緩沖液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,4 mol/L NaI)重懸,加入250 μl無(wú)水乙醇沉淀洗滌DNA,短時(shí)間真空干燥,使用30 μl TE緩沖液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA)重懸沉淀。使用-96 gⅢ測(cè)序引物(5′-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3′)行全自動(dòng)測(cè)序(上海生工公司,中國(guó)),根據(jù)噬菌體多肽展示文庫(kù)附帶使用手冊(cè),讀取及翻譯噬菌體測(cè)序結(jié)果。

1.5 噬菌體ELISA驗(yàn)證

取噬菌體單克隆貯液,常規(guī)擴(kuò)增、純化、滴定。陽(yáng)性孔采用CD44v3-v10重組蛋白(1 μg/孔)加入100 μl 0.84% NaHCO3(W/V,pH 8.4),陰性孔采用3%(W/V) BSA,4 ℃過(guò)夜包被酶標(biāo)板,3% BSA封阻滿(mǎn)孔2 h。分別加入待測(cè)克隆以及隨機(jī)對(duì)照克隆(1011pfu/孔),37 ℃孵育1 h,常規(guī)洗滌。加入0.1% TBST稀釋的山羊抗M13噬菌體衣殼蛋白多克隆抗體(稀釋度1 ∶1 000,V/V),加入0.1% TBST稀釋的HRP標(biāo)記兔抗山羊抗體(稀釋度1 ∶5 000,V/V),一二抗均37 ℃孵育1 h,常規(guī)洗滌。TMB顯色試劑盒顯色,2 mol/L H2SO4終止反應(yīng),酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處讀取吸光度。

1.6 噬菌體洗脫試驗(yàn)

分別接種SGC-7901、HEK-293于6孔培養(yǎng)板,待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層。4%多聚甲醛固定液4 ℃固定,3% BSA 37 ℃封閉30 min。每孔加入1011pfu待測(cè)噬菌體或隨機(jī)對(duì)照噬菌體與細(xì)胞37 ℃孵育1 h,0.1% TBST洗板6次,加入1 ml甘氨酸-鹽酸洗脫緩沖液(1.5%甘氨酸,0.1%BSA,W/V,pH 2.2),室溫洗脫,150 μl中和緩沖液(12.1%Tris,W/V,pH 9.1)中和,洗脫物采用1.3所述方法滴定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)采用SPSS19.0(SPSS, US),計(jì)量數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,組間差異比較采用t檢驗(yàn),P<0.05被視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD44v3-v10蛋白的Nanodics組裝

對(duì)包被后的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證可以發(fā)現(xiàn),圖1A展示了包被后的左側(cè)泳道相較右側(cè)出現(xiàn)新增的大分子量條帶,提示已形成Nanodiscs化的CD44v3-v10蛋白。隨后在分子排阻色譜的進(jìn)一步鑒定中發(fā)現(xiàn),有明確的產(chǎn)物峰形成(見(jiàn)圖1B),在產(chǎn)物峰前較低的峰可能提示了一些非特異性聚體的形成所產(chǎn)生的更大直徑納米盤(pán),或者CD44v3-v10蛋白分子之間胞外段的交聯(lián)。在前期預(yù)試驗(yàn)中,通過(guò)對(duì)反應(yīng)時(shí)間的控制,將非特異峰值控制于最低水平。

圖1 CD44v3-v10蛋白的Nanodiscs組裝檢測(cè)Figure 1 Detection of CD44v3-v10 assembled Nanodiscs

2.2 針對(duì)Nanodiscs的噬菌體展示

整個(gè)篩選過(guò)程中包括陰性消減及陽(yáng)性篩選,增加篩選效力。洗脫目標(biāo)噬菌體時(shí)采用了單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)性洗脫,以保證所獲得噬菌體的特異性。整個(gè)篩選重復(fù)4次用于富集陽(yáng)性噬菌體,并逐步降低非特異結(jié)合噬菌體所占比例。前三輪的洗脫噬菌體在下一輪篩選前均進(jìn)行擴(kuò)增,一方面保證篩選的力度及有效性,一方面可以使數(shù)量多的噬菌體進(jìn)行指數(shù)級(jí)別富集,提高陽(yáng)性噬菌體的比例。每輪篩選需滴定后計(jì)算回收率(產(chǎn)出噬菌體/投入噬菌體)。圖2A為第4輪篩選后102級(jí)別噬菌體滴定結(jié)果,圖2B提示了四輪篩選的回收率變化,可見(jiàn)隨著篩選進(jìn)行,回收率逐漸升高,四輪分別為10-7,10-5,10-4,10-3級(jí)別,提示陽(yáng)性噬菌體所占比例逐漸增多以及目標(biāo)噬菌體的富集效應(yīng)。

圖2 噬菌體展示的滴定及篩選回收率Figure 2 Phage titer and recovery rates of phage display

第4輪篩選結(jié)束后,對(duì)隨機(jī)的30個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行測(cè)序分析。根據(jù)噬菌體隨機(jī)十二肽展示文庫(kù)手冊(cè)中的方法對(duì)測(cè)序結(jié)果分析,尋找限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)KpnⅠ以及EgalⅠ的酶切位點(diǎn)GGTACC和CGGCCG,從而獲得插入DNA序列,再利用M13噬菌體專(zhuān)屬密碼子表進(jìn)行翻譯,最終獲得噬菌體所展示的12肽序列。表1展示了所挑選30個(gè)噬菌體所攜帶的多肽序列。30個(gè)噬菌體克隆共攜帶6條多肽序列,分別命名為:NP-1(HNTPSVRHFYKQ)、NP-2(HNTYVTSFHRNY)、NP-3(WQKPSHIPFNAS)、NP-4(QTALYSKPGPPV)、NP-5(ELYYHNTDIESQ)、NP-6(YHWEAYSTTPIS)。6條序列重復(fù)中重復(fù)的噬菌體克隆分別為8次、12次、4次、3次、2次、1次。重復(fù)次數(shù)更多的序列體現(xiàn)出篩選過(guò)程中的富集效應(yīng),相較重復(fù)少的序列親和力可能更好,因此也是后續(xù)驗(yàn)證的重點(diǎn)。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)NP-1和NP-2、NP-2與NP-5分別包含有一個(gè)重復(fù)的三肽基序HNT,可能是多肽結(jié)合于靶蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。

表1 噬菌體展示多肽序列及重復(fù)情況Table 1 Peptide sequence and repetition frequency of phage display

2.3 親和配體序列的選擇

噬菌體ELISA是用于鑒定噬菌體單克隆的常用方法。為排除結(jié)合于Nanodiscs其他成分的噬菌體,選擇固相包被較高量的CD44v3-v10蛋白作為噬菌體結(jié)合的靶點(diǎn)。6個(gè)待測(cè)噬菌體克隆、陰性對(duì)照隨機(jī)序列克隆(unrelated random phage,Urps)以及空白對(duì)照噬菌體溶劑TBS,分別結(jié)合于靶蛋白包被孔以及BSA陰性對(duì)照孔。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)包括噬菌體與靶蛋白結(jié)合的吸光度絕對(duì)值,還包括噬菌體與靶蛋白、BSA吸光度的比值,分別代表了噬菌體結(jié)合的親和性及特異性。圖3A展示了ELISA驗(yàn)證待測(cè)噬菌體及對(duì)照噬菌體針對(duì)靶蛋白及對(duì)照蛋白的檢測(cè)結(jié)果,可見(jiàn)噬菌體與靶蛋白結(jié)合的吸光度絕對(duì)值自高到低順序?yàn)镹P-2、NP-5、NP-1、NP-2、NP-4、NP-3、NP-6,靶蛋白、BSA吸光度的比值自高到低順序與此一致。因此選擇親和性及特異性表現(xiàn)均最好的NP-2、NP-5、NP-1三個(gè)序列做進(jìn)一步的鑒定。

由于本研究以獲取結(jié)合于CD44v天然活性形式的配體為主要目的,因此在使用固相包被蛋白確定了特異性噬菌體待測(cè)克隆后,繼續(xù)選擇了CD44v6不同表達(dá)情況的人細(xì)胞做進(jìn)一步結(jié)合驗(yàn)證。圖3B為噬菌體洗脫試驗(yàn)結(jié)果?？梢园l(fā)現(xiàn)NP-2、NP-5、NP-1三個(gè)克隆均與CD44v6陽(yáng)性細(xì)胞SGC-7901結(jié)合更多,結(jié)合噬菌體計(jì)數(shù)高于其與CD44v6陰性細(xì)胞HEK-293的結(jié)合噬菌體數(shù)(P<0.05),也高于無(wú)關(guān)隨機(jī)對(duì)照克隆在SGC-7901細(xì)胞上的結(jié)合數(shù)量(P<0.05)。3個(gè)克隆中,NP-2、NP-1的結(jié)合噬菌體為107數(shù)量級(jí),而NP-5僅為105數(shù)量級(jí)。此外,NP-2與陰性細(xì)胞結(jié)合噬菌體僅為105數(shù)量級(jí),而NP-1與陰性細(xì)胞結(jié)合噬菌體為106數(shù)量級(jí)。從結(jié)合力、選擇性?xún)煞矫婢C合考慮,NP-2為此次篩選獲得的最優(yōu)序列。

Urps:隨機(jī)無(wú)關(guān)克隆;TBS:空白對(duì)照?qǐng)D3 待選噬菌體克隆的鑒定Figure 3 Identification of canditate phages

3 討論

CD44是多種重要的腫瘤標(biāo)記物,現(xiàn)有報(bào)道支持了其與腫瘤的相關(guān)性。CD44作為細(xì)胞黏附分子,可以促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附,調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能,調(diào)節(jié)細(xì)胞偽足形成以及其遷移運(yùn)動(dòng)[9]。CD44的不同剪切表達(dá)以及與透明質(zhì)酸等配體的結(jié)合在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用[10]。CD44與腫瘤的關(guān)系主要包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制凋亡、以及促進(jìn)腫瘤侵襲遷移等方面[11-14]。

在已知藥物的靶點(diǎn)蛋白中,大多數(shù)為膜蛋白,因其定位于細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu),避免了細(xì)胞外分泌蛋白對(duì)探針定位的干擾,而且以胞外段為靶點(diǎn)也無(wú)需探針具備穿膜特性。CD44分子是跨膜糖蛋白,包含有胞外段,跨膜段以及胞內(nèi)段3個(gè)部分,胞外段所占分子量最大,是理想的藥物靶點(diǎn)。但CD44胞外段存在多種剪切表達(dá)結(jié)構(gòu),構(gòu)成多種轉(zhuǎn)錄變異體。其中包含有變異型外顯子編碼區(qū)的CD44分子在普通細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞間具有最明顯的表達(dá)差異,具有最好的腫瘤特異性[15]。其中, CD44v6的腫瘤靈敏性及特異性最為理想,因此也成為靶向藥物研發(fā)的熱點(diǎn),其單克隆抗體比伐珠單抗(bivatuzumab)在頭頸部腫瘤的治療中已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,但卻因抗體藥物引發(fā)的致死性毒副反應(yīng)被終止研究[3]。

傳統(tǒng)的常用的靶向藥物包括抗體類(lèi)、小分子類(lèi)。但抗體分子量大,免疫原性過(guò)高,成本及運(yùn)輸儲(chǔ)存條件制約性過(guò)大,小分子類(lèi)易于獲取,但缺乏抗體分子多樣性所帶來(lái)的高特異性和高親和力[16]。多肽類(lèi)藥物是近年研究較多的靶向藥物種類(lèi),有著結(jié)構(gòu)多樣、特異性好、代謝快、免疫原性低、價(jià)格低廉的多種優(yōu)勢(shì)[16]。

噬菌體展示肽庫(kù)是獲得特異性親和多肽的高通量篩選方法。該技術(shù)的靶點(diǎn)可以是蛋白、核酸等分子,也可以是細(xì)胞、離體或者活體組織[17]?，F(xiàn)有報(bào)道中,使用細(xì)胞、組織篩選的多肽藥物具體的分子靶點(diǎn)多不明確[4,18]。由于細(xì)胞、組織表面成分復(fù)雜,后續(xù)可能需要免疫共沉淀、蛋白組學(xué)研究尋找可能的分子靶點(diǎn),試驗(yàn)難度相對(duì)大,影響因素也比較多[19]。使用重組蛋白,在篩選過(guò)程中進(jìn)行固相包被會(huì)損害大分子蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu),難以實(shí)現(xiàn)分子在體內(nèi)的狀態(tài),為日后的應(yīng)用帶來(lái)限制。

CD44是膜蛋白,只有在雙層膜及類(lèi)脂環(huán)境中才能保證活性狀態(tài),體外難以模擬,而在細(xì)胞中表達(dá)量往往較低,不足以實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格的消減篩選[20]。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)活性膜蛋白的研究,近年出現(xiàn)了磷脂納米盤(pán)(Nanodisc)技術(shù)。它是通過(guò)在體外模擬細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu),使用高密度脂蛋白中的ApoA-1蛋白改造形成膜腳手架蛋白(MSP),該蛋白可以包裹磷脂雙分子形成類(lèi)膜結(jié)構(gòu),靶點(diǎn)膜蛋白可以組裝于這種類(lèi)膜結(jié)構(gòu)上以獲得其活性形式[8]。

膜蛋白的Nanodics組裝包括3個(gè)要點(diǎn),首先是膜蛋白的獲取,然后是蛋白、磷脂、骨架蛋白的包被比例及條件,最后是對(duì)包被結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。由于膜蛋白的分離純化較為復(fù)雜,難以獲得單一蛋白,因此擬以重組蛋白作為靶蛋白。CD44v3-v10 (NP 001001389.1) 蛋白是已知天然人源性CD44中,包含全部腫瘤相關(guān)結(jié)構(gòu)域的異構(gòu)體,其cDNA也可以實(shí)現(xiàn)常規(guī)文庫(kù)的釣取。在重組蛋白的載體選擇中,優(yōu)先選取了人源性細(xì)胞作為表達(dá)來(lái)源,因其可提供最接近于自然狀態(tài)下的CD44形態(tài)及高級(jí)結(jié)構(gòu),提高后續(xù)篩選配體在實(shí)際應(yīng)用中的親和力及特異性。

Nanodisc通過(guò)MSP蛋白包裹磷脂雙分子形成類(lèi)膜結(jié)構(gòu),靶點(diǎn)膜蛋白可以組裝于這種類(lèi)膜結(jié)構(gòu)上以獲得其活性形式。其中膜蛋白與MSP蛋白的比值最為重要。為避免多個(gè)膜蛋白結(jié)合于一個(gè)Nanodiscs或膜蛋白分子之間發(fā)生非特異性結(jié)合,本研究采取過(guò)量MSP蛋白,這也是大多數(shù)研究采取的方法[8]。而MSP蛋白與磷脂的投入比相對(duì)固定。本研究采用了商品化的Nanodiscs 試劑盒,可提供既定的MSP及磷脂投放量。

噬菌體展示可以實(shí)現(xiàn)對(duì)固相及液相靶蛋白的篩選,固相包被相對(duì)需要的靶蛋白量較多,且不利于Nanodiscs中膜蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的充分展示,因此本研究選擇了液相篩選方法。為實(shí)現(xiàn)目標(biāo)噬菌體的收集,靶蛋白包被時(shí)采用了His-tag-MSP蛋白,篩選時(shí)可利用Ni-NTA 磁珠進(jìn)行特異性吸附。在每輪篩選前,噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)需要與BSA進(jìn)行非特異性結(jié)合,以消減篩選的形式減少非特異性吸附的產(chǎn)生。陽(yáng)性篩選過(guò)程通過(guò)逐漸增加強(qiáng)度的洗滌除去親和力不足的噬菌體。在獲取結(jié)合噬菌體時(shí)采取CD44v6單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)性洗脫。以保證獲取噬菌體均結(jié)合于該抗原決定簇。

在對(duì)CD44v3-v10蛋白包被后,使用了SDS-PAGE及分子排阻色譜雙重鑒定。兩種驗(yàn)證均提示大量產(chǎn)物形成,因此可以考慮進(jìn)行下一步的篩選。在噬菌體展示篩選過(guò)程中,可以發(fā)現(xiàn)第1輪回收率僅10-7級(jí)別,有較強(qiáng)的篩選力度,而后回收率逐輪上升,第4輪上升至10-3級(jí)別,提示了有效噬菌體在每輪次級(jí)庫(kù)中的比例逐漸升高。對(duì)獲取克隆的測(cè)序發(fā)現(xiàn),待選噬菌體出現(xiàn)了比較明顯的富集現(xiàn)象,30個(gè)克隆僅攜帶6條序列,重復(fù)最高的序列占所有克隆的40%。其中兩條序列還出現(xiàn)了相同的三肽基序,證明篩選的有效性,而這個(gè)三肽基序則可能是整條多肽結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。

為了排除結(jié)合于Nanodisc其他成分的噬菌體,噬菌體ELISA檢驗(yàn)中僅使用靶蛋白而非組裝好的Nanodisc。檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),陽(yáng)性克隆結(jié)合于靶蛋白明顯高于對(duì)照蛋白,也高于對(duì)照克隆,證明所篩選的陽(yáng)性克隆對(duì)靶蛋白的特異性。而經(jīng)過(guò)綜合考慮每個(gè)克隆與靶蛋白結(jié)合的OD值,以及與對(duì)照蛋白結(jié)合的情況,對(duì)待選噬菌體進(jìn)行了初篩,排除部分結(jié)合較低或特異性差的噬菌體。繼而待測(cè)克隆還需結(jié)合于細(xì)胞水平表達(dá)的靶蛋白,以確定噬菌體與靶蛋白活性形式的結(jié)合力及特異性。噬菌體細(xì)胞洗脫試驗(yàn)也證實(shí)了幾個(gè)待測(cè)克隆對(duì)靶蛋白腫瘤細(xì)胞以及靶蛋白陰性細(xì)胞的結(jié)合。NP-2噬菌體因其結(jié)合力及結(jié)合特異性被選擇為最佳序列。后續(xù)工作會(huì)將篩選獲得的多肽序列進(jìn)一步合成探針,檢驗(yàn)其體內(nèi)外與靶蛋白、靶細(xì)胞的結(jié)合,為CD44v6陽(yáng)性腫瘤的靶向診斷及靶向治療提供方法和臨床前期基礎(chǔ)。