豬源金黃色葡萄球菌分離鑒定及16srRNA基因遺傳進(jìn)化分析

張小冬 郭曉銀 王貴平 胡仕鳳 尹 崇

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128）

1 前言

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種人畜共患病原菌，在顯微鏡下呈現(xiàn)葡萄串狀。金葡菌可以引起豬多種感染，包括皮膚和組織感染、毒素介導(dǎo)的疾病和細(xì)菌性貧血。隨著抗生素的應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性大量增加，甚至出現(xiàn)對(duì)已有的抗生素都耐受的“超級(jí)細(xì)菌”，給臨床治療帶來了極大的困擾，嚴(yán)重威脅用藥及公共衛(wèi)生安全。動(dòng)物是金葡菌的“蓄水池”，調(diào)查動(dòng)物源金葡菌具有重大公共安全和食品安全意義，可對(duì)醫(yī)學(xué)上治療金葡菌感染提供參考依據(jù)。本研究對(duì)湖南地區(qū)規(guī)模化豬場采集的300份病料，進(jìn)行金葡菌的分離鑒定和16Sr RNA基因進(jìn)化樹構(gòu)建和分析。

2 材料與方法

2.1 樣品

2018.10-2019.9湖南地區(qū)養(yǎng)豬場采集的樣品300份，并做好詳細(xì)記錄。

2.2 主要試劑

血瓊脂培養(yǎng)基、凍干兔血漿和甲苯胺藍(lán)-DNA酶平板均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；DNA試劑盒購自上海生工有限公司；7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基/固體瓊脂培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)室配制。

2.3 主要儀器

PCR儀：美國A B公司；生物安全柜：力康發(fā)展有限公司；高速離心機(jī)：北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；生物顯微鏡：奧林巴斯工業(yè)有限公司。

2.4 金黃色葡萄球菌分離培養(yǎng)

合理處理肺臟和拭子后，加入 7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基中，置變頻搖床37 ℃培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)取菌液少許，在培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后挑取單菌落，在7.5%氯化鈉固體瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)獲得分離菌，挑取單個(gè)菌落革蘭氏染色。

2.5 生化試驗(yàn)

分離菌觸酶試驗(yàn)、糖（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和甘露醇）發(fā)酵試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)和耐熱核酸酶試驗(yàn)。上述試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)均參考伯杰氏手冊(cè)，簡單描述如下：觸酶試驗(yàn)中有氣體產(chǎn)生，判為為陽性。糖發(fā)酵試驗(yàn)和VP試驗(yàn)反應(yīng)中出現(xiàn)顏色變化判為陽性。溶血試驗(yàn)出現(xiàn)溶血環(huán)判為陽性。血漿凝固酶試驗(yàn)在凍干兔血漿生化管中出現(xiàn)凝固現(xiàn)象判為陽性。在耐熱核酸酶試驗(yàn)中，甲笨胺藍(lán)-DNA瓊脂培養(yǎng)基中的小洞（灌滿菌液后培養(yǎng)24h）周圍出現(xiàn)淡紅色，判為陽性。

2.6 PCR鑒定

提取DNA為模板，用16S rRNA基因和nuc基因擴(kuò)增分離菌。16s rRNA和nuc引物均由生工（上海）公司合成。將擴(kuò)增PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%凝膠電泳后，出現(xiàn)陽性條帶的，送去生工測序。測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析并構(gòu)建進(jìn)化樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 形態(tài)學(xué)觀察

純化株在固體瓊脂培養(yǎng)基上，形成菌落厚不透明的菌落，革蘭染色結(jié)果顯示為直徑大小0.8μm左右，單個(gè)、成雙或成串的葡萄球狀的紫色球菌如圖1。

圖1 分離菌革蘭染色（1000×）

3.2 生化試驗(yàn)

生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。所有分離株觸酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)和耐熱核酸酶試驗(yàn)均為陽性。92.3%的分離株血漿凝固酶試驗(yàn)為陽性。這些結(jié)果符合伯杰氏手冊(cè)（don et al，2014）中對(duì)金葡菌生化特性的描述。

3.3 PCR結(jié)果

對(duì)生化鑒定符合金葡菌生化特性的分離菌，利用16S rRNAPCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出1500bp大小的目的片段（圖2）。同時(shí)用金葡菌特異性基因—耐熱核酸酶nuc基因進(jìn)行PCR檢測。

表1 65株分離菌生化結(jié)果

均擴(kuò)增出557bp大小的目的片段（圖3）。隨機(jī)挑選部分菌株進(jìn)行測序，在NCBI發(fā)現(xiàn)與Genbank公布的S.aureus相似度均高于99%，確定為分離菌均為金葡菌。

圖2 16s rRNA擴(kuò)增結(jié)果

圖3 nuc基因擴(kuò)增結(jié)果

3.4 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

在金葡菌分離株中隨機(jī)挑選了5株菌株進(jìn)行測序，BALST后在NCBI上傳了序列HN001-005登錄號(hào)分別為HN650258、MN650259、MN650260、MN650918、MN652637。并進(jìn) 行了 16S rRNA基因進(jìn)化樹的構(gòu)建，進(jìn)化樹表明HN001-005分離株與金葡菌的相似性為98.0%-100%，顯示分離菌HN001與金葡菌GHA10、分離菌HN002和分離菌HN003與金葡菌HAR1親緣性最近并在同一進(jìn)化支上。

3.5 分離結(jié)果統(tǒng)計(jì)

所有用于分離金葡菌的樣品300份均來源于湖南省長沙市等9地（表2）。所有樣品中金葡菌總分離率為21.67%，其中肺臟分離率為21.52%，拭子分離率為21.79%；母豬分離率為19.71%，仔豬分離率為23.41%（表2）。建議豬源金葡菌分離的最佳樣品為仔豬肺臟和仔豬拭子。

表2 金黃色葡萄球菌菌株分離的統(tǒng)計(jì)

4 討論

豬葡萄球菌感染的主要致病菌為金葡菌。本文根據(jù)分離株形態(tài)、生化特性和16S rRNA基因以及金葡菌特異性基因—耐熱核酸酶基因nuc 合成引物進(jìn)行PCR反應(yīng)鑒定為金葡菌。在300份樣品金葡菌分離率為21.67%（65/300），其中肺臟分離率為21.52%，拭子分離率為21.79%；母豬分離率為19.71%，仔豬分離率為23.41%。仔豬分離要高于母豬的分離率，這可能是仔豬免疫力低于成年豬，也與養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理?xiàng)l件等因素有關(guān)。

金葡菌產(chǎn)生的凝固酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積，從而產(chǎn)生凝固現(xiàn)象。金葡菌形成的感染局部化與此酶有關(guān)。金葡菌引起血液感染的危險(xiǎn)因素與誘因較多，包括因靜脈導(dǎo)管、 氣管插管、手術(shù)等促使機(jī)體屏障功能完整性遭受破壞等導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降等多種因素有關(guān)。從豬血液中分離金葡菌的報(bào)道較少，本研究從豬血液中分離金葡菌，在30份豬血液中金葡菌的分離為0%，可能是樣本數(shù)較少或該菌并沒有侵襲到血液中等，所以在豬身上血液感染金葡菌幾率比較低。

16S rRNA是核糖體上小亞基上的RNA，這段序列在不同細(xì)菌的結(jié)構(gòu)、功能都具有高度保守性，完成測序后通過BLAST分析可以確定其同源性比較、用于細(xì)菌的系統(tǒng)分類鑒定、多樣性和親緣關(guān)系分析等。5株金葡菌的16S rRNA基因遺傳進(jìn)化樹表明湖南省地區(qū)存在著多種不同型的菌株。本研究對(duì)湖南省地區(qū)豬養(yǎng)殖場采集的樣品進(jìn)行金葡菌的分離鑒定和16S rRNA基因進(jìn)化樹的構(gòu)建對(duì)其感染情況和分布進(jìn)行了調(diào)查，為預(yù)防和治療豬金葡菌的感染提供參考依據(jù)。