血流感染和皮膚軟組織感染金黃色葡萄球菌耐藥特征及多位點(diǎn)序列分型

溫偉洪， 徐令清， 李玉珍， 李介華， 湯英賢， 黃延峰

金黃色葡萄球菌（金葡菌）是醫(yī)院感染與社區(qū)感染重要致病菌之一，可引起毒素性疾病和化膿性感染，常見于皮膚軟組織感染和血流感染。近年社區(qū)相關(guān)MRSA（community associated methicillin-resistantStaphylococcus aureus，CAMRSA）以及牲畜相關(guān)MRSA（livestock associated methicillin-resistantStaphylococcus aureus，LAMRSA）的出現(xiàn)使MRSA防治形勢更為嚴(yán)峻。了解金葡菌耐藥特征，可為臨床經(jīng)驗(yàn)用藥提供參考依據(jù)，減少抗生素不合理使用。金葡菌多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是基于對其7個管家基因測序的分子分型方法之一。管家基因高度保守，變化積累緩慢，因此金葡菌MLST主要用于了解菌株遺傳背景、起源和進(jìn)化，其優(yōu)勢在于具有高分型率及高重現(xiàn)性，不同實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)可比對，缺點(diǎn)是分辨能力相對較低[1]。為了協(xié)助臨床更好對金葡菌感染防治，本文對本院血流和皮膚軟組織感染金葡菌耐藥性及MLST特征進(jìn)行分析，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 本院微生物室于2015年8月－2016年7月自門診和住院患者血培養(yǎng)樣本分離出金葡菌47株，自膿液或抽吸物樣本分離出金葡菌62株，剔除同一患者重復(fù)分離株，共109株金葡菌。其中47例血培養(yǎng)金葡菌分離株的患者因均有發(fā)熱和寒戰(zhàn)癥狀，體溫≥38 ℃，經(jīng)臨床確診為血流感染。膿液或抽吸物培養(yǎng)出金葡菌的62例患者相應(yīng)部位均有紅、腫等皮膚炎癥表現(xiàn)，經(jīng)臨床確診為皮膚軟組織感染。質(zhì)控菌株為金葡菌ATCC 25923。

1.1.2 主要儀器和試劑 BD PhoenixTM100全自動細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)、復(fù)合鑒定板（美國BD公司），細(xì)菌DNA提取試劑盒（Magen公司），重組溶葡萄球菌酶（上海生工），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、凝膠電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 金葡菌鑒定及藥敏檢測 采用BD PhoenixTM100全自動細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)進(jìn)行金葡菌鑒定及藥敏檢測，藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)參照2016 CLSI M100-S26藥敏試驗(yàn)指南。夫西地酸藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)參照EUCAST藥敏試驗(yàn)指南，MIC≤1 mg/L為敏感，MIC≥2 mg/L為耐藥。MRSA判斷標(biāo)準(zhǔn)：金葡菌頭孢西丁MIC≥8 mg/L或苯唑西林MIC≥4 mg/L。金葡菌高水平莫匹羅星耐藥判斷標(biāo)準(zhǔn)：莫匹羅星MIC≥512 mg/L。

1.2.2 醫(yī)院相關(guān)MRSA（hospital associated methicillin-resistantStaphylococcus aureus，HAMRSA）、CA-MRSA判斷標(biāo)準(zhǔn) 按照衛(wèi)生部制定的醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者入院48 h后獲得感染并分離的MRSA判斷為HA-MRSA。門診患者或入院48 h內(nèi)獲得感染并分離的MRSA且患者1年內(nèi)無醫(yī)療結(jié)構(gòu)接觸史、無留置導(dǎo)管或醫(yī)療裝置判斷為CAMRSA[2]。

1.2.3 金葡菌MLST分型 按照MLST官網(wǎng)（http://saureus.mlst.net/）提供的引物序列、PCR反應(yīng)條件、反應(yīng)體系擴(kuò)增金葡菌7個管家基因（arcC、aroE、glpF、

gmk、pta、tpi、yqiL），擴(kuò)增產(chǎn)物送廣州勱致生物科技有限公司測序，測序結(jié)果與MLST官網(wǎng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對獲得金葡菌序列型（sequence type，ST）。7個管家基因中6個相同定義為同一克隆復(fù)合體（clone complex，CC），兩種ST在單個位點(diǎn)不同定義為單位點(diǎn)變異體（single locus variant，SLV）。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用WHONET 5.6軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)菌耐藥率，應(yīng)用SPSS 19.0軟件分析血流感染與皮膚軟組織感染金葡菌中MRSA檢出率差異，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血流感染與皮膚軟組織感染金葡菌耐藥特征

血流和皮膚軟組織感染MRSA檢出率分別為21.3%和61.3%（10/47和38/62），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。未發(fā)現(xiàn)高水平莫匹羅星耐藥金葡菌，對非β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥率和敏感率見表1。

2.2 血流感染金葡菌MLST結(jié)果

47株血流感染金葡菌共獲得18種ST，新型ST占10.6%（5/47）。ST965與ST5、ST630與ST239、ST338與ST59有一個位點(diǎn)不同，分別屬CC5、CC8、CC59，其他ST之間無遺傳相關(guān)性。10株MRSA含5種ST，最常見為ST59（40.0%，4/10），其次為ST45、ST188、ST239、ST338各1株；37株MSSA含16種ST，以ST7、ST188為主（各16.2%，6/37），其次為ST15（10.8%，4/37），見表2。

表1 血流和皮膚軟組織感染金葡菌對抗菌藥物耐藥率和敏感率Table 1 Susceptibility of the Staphylococcus aureus isolates associated with bloodstream infection and skin and soft tissue infection to antimicobial agents

表2 血流感染金葡菌MLST分型Table 2 Multilocus sequence typing for the Staphylococcus aureus isolates associated with bloodstream infection

表2 （續(xù)）Table 2（continued）

2.3 皮膚軟組織感染金葡菌MLST結(jié)果

62株皮膚軟組織感染金葡菌共獲得18種ST，新型ST占12.9%（8/62）。ST965與ST5，ST630與ST239，ST338、ST3188與ST59有一個位點(diǎn)不同，分別屬CC5、CC8、CC59，其他ST之間無遺傳相關(guān)性。38株MRSA含11種ST，最常見為ST338（47.4%，18/38），其次為ST59（13.2%，5/38）；24株MSSA含12種ST，以ST5、ST88為主（各12.5%，3/24），其次為ST7、ST188、ST398各2株，見表3。

表3 皮膚軟組織感染金葡菌MLST分型Table 3 Multilocus sequence typing for the Staphylococcus aureus isolates associated with skin and soft tissue infection

3 討論

MRSA對所有傳統(tǒng)β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥（青霉素類、第一至第四代頭孢菌素、碳青霉烯類抗菌藥物），其主要的耐藥機(jī)制為mecA基因或mecC基因介導(dǎo)的甲氧西林耐藥，2014－2016年CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示MRSA平均檢出率分別為44.6%、42.2%、38.4%[3-5]。本組資料結(jié)果顯示血流感染MRSA檢出率為21.3%，低于近年CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)報(bào)道MRSA平均檢出率。研究報(bào)道MSSA相對MRSA毒力基因攜帶率更高[6-7]，提示我們關(guān)注MRSA的同時(shí)，不能輕視MSSA感染。皮膚軟組織感染MRSA檢出率為61.3%，高于近年CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)報(bào)道MRSA平均檢出率，提示皮膚軟組織感染金葡菌可能存在MRSA克隆株流行。

本組資料結(jié)果顯示血流感染和皮膚軟組織感染金葡菌對非β內(nèi)酰胺類抗菌藥物有較高耐藥率的依次為紅霉素、克林霉素、四環(huán)素，其中克林霉素常推薦用于治療金葡菌引起的皮膚軟組織感染，而皮膚軟組織感染MRSA株和MSSA株對克林霉素耐藥率為分別為86.8%和29.2%，提示臨床克林霉素僅可經(jīng)驗(yàn)用于治療皮膚軟組織MSSA感染。對非β內(nèi)酰類抗菌藥物包括慶大霉素、環(huán)丙沙星、利福平、甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥率均≤30.0%，其中慶大霉素和利福平主要與敏感抗菌藥物聯(lián)合使用。對萬古霉素、利奈唑胺、替考拉寧、夫西地酸、高水平莫匹羅星耐藥率均為0，提示這些抗菌藥物可作為臨床治療金葡菌感染經(jīng)驗(yàn)用藥。

金葡菌MLST結(jié)果顯示血流感染MRSA株共有5種ST，文獻(xiàn)報(bào)道血流感染MRSA株優(yōu)勢ST為ST239、ST5[8-9]，本組資料最常見為ST59（4/10，40.0%），其次為ST45、ST188、ST239、ST338各1株；MSSA株共有16種ST，每種ST不超20%，最常見為ST7、ST188（各16.2%，6/37）。皮膚軟組織感染MRSA株共有11種ST，文獻(xiàn)報(bào)道皮膚軟組織感染MRSA株優(yōu)勢ST為ST59[10-11]，本組資料最常見為ST338（18/38，47.4%），其次為ST59（13.2%，5/38）；MSSA株共有12種ST，每種ST不超15%，最常見為ST5、ST88（各12.5%，3/24）。上述結(jié)果表明血流感染和皮膚軟組織感染MRSA株存在較明顯優(yōu)勢ST，而MSSA株ST呈多樣化分布。LA-MRSA或LA-MSSA多屬于ST398[12-13]，本組資料結(jié)果顯示ST398金葡菌檢出率為4.6%（5/109），其中為血流感染MSSA 1株，皮膚軟組織感染MRSA與MSSA各2株，本地區(qū)農(nóng)業(yè)人口較多，牲畜業(yè)較發(fā)達(dá)，因此需密切監(jiān)測ST398金葡菌的流行。近年有關(guān)CA-MRSA報(bào)道愈來愈多，CA-MRSA與HA-MRSA相比毒力更強(qiáng)[14]，能引起健康人群感染，因此CA-MRSA備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)CA-MRSA可侵入醫(yī)院引起醫(yī)院感染，而HA-MRSA可擴(kuò)散至社區(qū)[15-17]，本組資料血流感染和皮膚軟組織感染MRSA株MLST分型結(jié)果顯示，醫(yī)院和社區(qū)血流感染MRSA株中均檢出ST59型MRSA；醫(yī)院和社區(qū)皮膚軟組織感染MRSA株中均檢出ST45及ST338型，可見社區(qū)和醫(yī)院的遺傳背景愈來愈復(fù)雜，MRSA防控形式不容樂觀，相關(guān)部門應(yīng)采取嚴(yán)格防控措施，避免醫(yī)院與社區(qū)之間高耐藥、高毒力的MRSA交叉?zhèn)鞑ァ?/p>

本組資料結(jié)果顯示109株金葡菌MLST結(jié)果中ST338最常見（19.3%，21/109），其次是ST59（11.9%，13/109），ST338為ST59的SLV，同屬CC59。90.5%（19/21）ST338金葡菌分離自皮膚軟組織感染，而53.8%（7/13）ST59金葡菌分離自血流感染，46.2%（6/13）ST59金葡菌分離自皮膚軟組織感染，ST59金葡菌進(jìn)化到ST338金葡菌后是否產(chǎn)生毒力改變導(dǎo)致感染譜差異以及ST338金葡菌在皮膚軟組織感染流行機(jī)制有待日后研究。