補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)SCII模型大鼠細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白影響的研究*

★ 郭曉輝 卜保獻(xiàn) 李艷俠 耿捷 李寒曦（河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院 河南 洛陽(yáng) 471002）

脊髓缺血再灌注損傷（SCII）是指脊髓受壓缺血，經(jīng)過(guò)減壓后血液重新回流，出現(xiàn)神經(jīng)損傷加重的情況［1］。補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)于急性脊髓損傷方面的研究較多，但是對(duì)于脊髓缺血再灌注損傷細(xì)胞自噬方面的研究較少?；诖耍紤]將傳統(tǒng)中藥與脊髓缺血再灌注損傷相結(jié)合，從細(xì)胞自噬方面進(jìn)行研究，探討自噬發(fā)生的機(jī)制規(guī)律，嘗試運(yùn)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)細(xì)胞自噬，為中藥治療神經(jīng)細(xì)胞損傷提供一種新的思路。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)2月齡大鼠（SD）48只，雌雄各半，購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（晉）20150001，重量在230～250 g，分籠喂養(yǎng)。室溫在20℃～ 22℃，相對(duì)濕度45%～50%，12 h光暗循環(huán)，喂食過(guò)濾水和營(yíng)養(yǎng)飼料。實(shí)驗(yàn)過(guò)程及方法符合河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。

1.2 主要藥物、儀器及試劑 補(bǔ)陽(yáng)還五湯（黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，川芎4.5 g，赤芍4.5 g，地龍3 g，紅花3 g，桃仁3 g。上述藥物購(gòu)于河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院，并由該院制劑室加工成1mL湯藥含生藥4g，即4 g/mL質(zhì)量濃度，無(wú)菌封瓶，-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫徊±砬衅瑱C(jī)（德國(guó)Leica RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)）；脫水機(jī)（武漢俊杰JT-12J電腦生物組織脫水機(jī)）；組織攤烤片機(jī)（武漢俊杰JK-6生物組織攤烤片機(jī)）；顯微鏡（奧林巴斯BX53型生物顯微鏡）；無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)10009218）；蘇木素（Sigma，批號(hào)H9627）；包埋石蠟（國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)69019361）；Beclin 1（兔）（武漢三鷹，批號(hào)11306-1-AP）；P62（兔）（武漢三鷹，批號(hào)18420-1-AP）；LC3（兔）（武漢三鷹，批號(hào)14600-1-AP）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組、干預(yù)及造模 48只大鼠采用完全隨機(jī)數(shù)字法分組，隨機(jī)分為：假手術(shù)組、模型組、觀察組和3-MA組，每組12只。每組在缺血再灌注后3 h、6 h相應(yīng)分為2組，每小組6只。按照大鼠的重量，腹腔內(nèi)注射配置好的氯胺酮注射液（配置標(biāo)準(zhǔn)：10 mg/kg）。大鼠按照文獻(xiàn)［2］進(jìn)行造模：腹部正中切開(kāi)，逐層切開(kāi)，到達(dá)腹腔后，把腸管拉向右側(cè)，溫鹽水敷料覆蓋，找到左腎動(dòng)脈與腹主動(dòng)脈，在左腎動(dòng)脈下約1 cm處用動(dòng)脈夾閉腹主動(dòng)脈。計(jì)時(shí)40 mim后，開(kāi)放腹主動(dòng)脈。再灌注時(shí)間以松夾瞬間開(kāi)始計(jì)算。假手術(shù)組：分離出腹主動(dòng)脈后，根據(jù)余組夾閉時(shí)間確定腹腔內(nèi)注射0.9%的生理鹽水1 mL。模型組：分離腹主動(dòng)脈后，完全夾閉腹主動(dòng)脈40 min后放開(kāi)。放開(kāi)的時(shí)候立即腹腔內(nèi)注射0.9%的生理鹽水1 mL。觀察組： 在造模的前三天給予制備好的補(bǔ)陽(yáng)還五湯1 mL灌胃，每天兩次，造模過(guò)程同上。3-MA組：腹腔注射按照劑量為15μg/g比例配置的3-MA注射液，然后完全夾閉腹主動(dòng)脈，夾閉腹主動(dòng)脈40 min后開(kāi)放。

1.4 取材 ①缺血再灌注3 h、6 h后觀察各組大鼠活動(dòng)，然后進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，再進(jìn)行腹腔注射麻醉（同前）。②麻醉成功后，切開(kāi)胸腔，在升主動(dòng)脈內(nèi)進(jìn)行置管，先灌注生理鹽水，等到右心房剪開(kāi)后有清亮液體流出時(shí)，換用10%的甲醛再次進(jìn)行灌注，待大鼠僵硬后，俯臥位固定。背部正中切開(kāi)，分離椎旁肌，顯露出棘突及椎板，然后用小型咬骨鉗咬除，暴露出硬膜囊。③用鋒利刀片先將脊神經(jīng)切斷，然后分離出L2-5段脊髓，迅速將兩端切斷，分為兩部分。一部分浸泡于10%福爾馬林溶液內(nèi)，另一部分存放于-80℃冰箱內(nèi)。

1.5 大鼠脊髓損傷后行為學(xué)評(píng)價(jià) 在缺血再灌注3 h、6 h后進(jìn)行改良Tarlov行為學(xué)評(píng)分［3］。改良Tarlov行為學(xué)評(píng)分：后肢完全癱瘓，無(wú)可察覺(jué)的后肢活動(dòng)，0分；后肢輕微移動(dòng)，但無(wú)法對(duì)抗重力，1分；后肢可運(yùn)動(dòng)，但無(wú)法對(duì)抗重力，2分；能行走或跳躍，但有明顯共濟(jì)失調(diào)，3分；后肢步態(tài)正常，能正常跳躍，4分。

1.6 免疫組化檢測(cè)各組脊髓組織中蛋白 Beclinl 、 LC3、P62的表達(dá)情況。

1.7 透視電鏡檢測(cè)細(xì)胞自噬情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）來(lái)表達(dá)。每組均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析，各組比較若方差齊性，采用最小顯著差法（LSD）；組間比較若方差不齊，采用Dnnett法。設(shè)置檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 SCII后行為學(xué)評(píng)分比較 假手術(shù)組在缺血3 h后與余組比較，行為學(xué)評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組、觀察組、3-MA組均存在后側(cè)肢體功能障礙，其中模型組癥狀最重，而觀察組與3-MA組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在缺血6 h后，假手術(shù)組與模型組、3-MA組比較，行為學(xué)評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組、3-MA組仍存在后側(cè)肢體功能障礙，但是3-MA組癥狀較輕。而假手術(shù)組與觀察組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明兩組癥狀基本一致。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠脊髓損傷后行為學(xué)評(píng)分比較（，n=12） 分

表1 各組大鼠脊髓損傷后行為學(xué)評(píng)分比較（，n=12） 分

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與3-MA組比較，③P<0.05。

組別 缺血3h 缺血6h假手術(shù)組 4.00 4.00模型組 0.67±0.58① 1.33±0.58①觀察組 2.63±0.58②③ 3.75±0.58②③3-MA組 2.00±0.21② 3.00±0.19②

2.2 免疫組化檢測(cè)各組脊髓組織中蛋白Beclinl 、 LC3、P62的表達(dá)變化 詳見(jiàn)表2。在缺血3 h后，假手術(shù)組和余組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組與觀察組、3-MA組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。觀察組和3-MA組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表2 各組在缺血3 h后免疫組化積分光密度值（IOD）的比較（，n=12） 分

表2 各組在缺血3 h后免疫組化積分光密度值（IOD）的比較（，n=12） 分

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與3-MA組比較，③P<0.05。

組別 Beclin 1 LC3 P62假手術(shù)組 1.571±0.654 2.697±0.500 1.203±0.263模型組 6.595±1.130① 6.866±3.330① 8.309±3.837①觀察組 3.300±0.365② 3.533±1.562② 3.605±1.365②③3-MA組 2.838±1.791② 3.498±2.538② 2.912±1.376②

在缺血6h后，假手術(shù)組和余組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組與觀察組、3-MA組進(jìn)行比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。觀察組和3-MA組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

表3 各組在缺血6 h后免疫組化積分光密度值（IOD）的比較（，n=12） 分

表3 各組在缺血6 h后免疫組化積分光密度值（IOD）的比較（，n=12） 分

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P<0.05；與3-MA組比較，③P<0.05。

組別 Beclin 1 LC3 P62假手術(shù)組 1.327±0.266 2.365±0.095 1.498±0.038模型組 5.577±2.587① 6.735±1.209① 5.915±1.562①觀察組 3.610±1.301②③ 3.569±1.126②③ 3.304±1.016②③3-MA組 4.509±1.626② 5.353±2.151② 4.689±1.083②

2.3 透射電鏡超微結(jié)構(gòu)結(jié)果 假手術(shù)組大鼠脊髓組織神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)基本正常，核型規(guī)則為圓形或橢圓形，核膜完整，核內(nèi)染色質(zhì)均勻，核仁明顯。胞質(zhì)中細(xì)胞器形態(tài)分布及數(shù)目正常，髓鞘圍繞軸索呈同心圓排列，軸索內(nèi)有微絲和微管，排列規(guī)則，未見(jiàn)軸漿變性及顆粒狀崩解（詳見(jiàn)圖a，b）。模型組3 h后、6 h后可見(jiàn)脊髓組織神經(jīng)元胞漿廣泛水腫，線粒體腫脹、空泡化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)松散，游離核糖體增多，溶酶體形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞中有大量由單層膜組成的自噬囊泡，其中有高電子密度的吞噬顆粒（即自噬小體）（詳見(jiàn)圖1c，d）。觀察組3 h后髓鞘水腫明顯，髓鞘板層圍繞軸索呈同心圓排列，軸索內(nèi)有微絲和微管，排列較紊亂，但未見(jiàn)軸漿變性及顆粒狀崩解，線粒體腫脹、空泡化，可見(jiàn)部分自噬小體。觀察組6 h后髓鞘水腫明顯減退，神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)基本正常，核型規(guī)則為圓形或橢圓形，核膜完整，核內(nèi)染色質(zhì)均勻，核仁明顯，髓鞘板層圍繞軸索呈同心圓排列，軸索內(nèi)有微絲和微管，排列規(guī)則，自噬小體減少（詳見(jiàn)圖1e，f）。3-MA組3 h后、6 h后髓鞘板層圍繞軸索呈同心圓排列，軸索內(nèi)有微絲和微管，排列較紊亂，線粒體腫脹、空泡化，但未見(jiàn)軸漿變性及顆粒狀崩解，未見(jiàn)明顯自噬小體（詳見(jiàn)圖1g，h）。

圖1 透射電鏡超微結(jié)果 （放大倍率5000×）

3 討論

自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3和P62可反映自噬過(guò)程中自噬的發(fā)生和強(qiáng)度。本研究中，在缺血3h后、6 h后，模型組、觀察組、3-MA組在Beclin1、LC3和 P62三種蛋白的表達(dá)方面與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示模型組、觀察組、3-MA組中三種蛋白的表達(dá)均較假手術(shù)組上調(diào)，其中模型組中Beclin1、LC3和P62三種蛋白的表達(dá)上調(diào)尤其明顯。從行為學(xué)上分析，在缺血3 h后、6 h后，除了假手術(shù)組外，其余三組大鼠均有后側(cè)肢體功能障礙的的表現(xiàn)，其中模型組最為嚴(yán)重，觀察組隨著時(shí)間的推移，后肢功能障礙癥狀改善基本達(dá)到了和假手術(shù)組一致。透視電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組中自噬小體數(shù)量較多，細(xì)微結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，而觀察組自噬小體數(shù)量沒(méi)有模型組多，隨著時(shí)間的推移，自噬小體數(shù)量減少，細(xì)微結(jié)構(gòu)也在逐漸的修復(fù)中。從以上結(jié)果分析可見(jiàn)，模型組中Beclin1、LC3和P62三種蛋白的表達(dá)上調(diào)最為明顯，說(shuō)明該組發(fā)生細(xì)胞自噬的情況最為嚴(yán)重，該組的行為學(xué)評(píng)分與電鏡檢測(cè)的結(jié)果也印證了這種情況。而觀察組與3-MA組中三種蛋白的表達(dá)雖然也有表達(dá)上調(diào)的情況，但是上調(diào)的程度較模型組要小，說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯與自噬抑制劑3-MA可能對(duì)Beclin1、LC3 和 P62三種蛋白的表達(dá)具有抑制或調(diào)節(jié)作用，從而影響了細(xì)胞自噬過(guò)程中自噬的發(fā)生與強(qiáng)度。

自噬具有兩面性。缺血和再灌注可以引起脊髓神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)自噬的發(fā)生，而自噬又是導(dǎo)致細(xì)胞損傷、死亡的重要因素［4］。目前研究發(fā)現(xiàn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害或退變過(guò)程中，自噬會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用，減少細(xì)胞死亡。有研究報(bào)道，自噬在器官缺血階段被激活，通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)衰老細(xì)胞器及錯(cuò)誤折疊蛋白中起重要作用對(duì)細(xì)胞的保護(hù)性作用［5］。另有研究報(bào)道，大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是血腦屏障被破壞的起始步驟，也是造成缺血再灌注損傷患者預(yù)后效果不理想的主要原因，而激活后的自噬可減輕再灌注后大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，有益于血腦屏障的完整性，由此推斷自噬的存在可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，避免死亡［6］。自噬是細(xì)胞具有的應(yīng)激與防御機(jī)制。自噬可以消化、降解受損、衰老、失能的細(xì)胞，給予細(xì)胞的再生、重建提供原料，使細(xì)胞實(shí)現(xiàn)新陳代謝，保護(hù)細(xì)胞免受損害。另有研究進(jìn)行報(bào)道，過(guò)度的自噬會(huì)導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡，這種自噬性細(xì)胞死亡常常伴隨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的現(xiàn)象，因此有人猜測(cè)自噬過(guò)度時(shí)，有可能會(huì)觸發(fā)細(xì)胞的凋亡程序而引起細(xì)胞死亡［7］，同時(shí)，也有研究認(rèn)為自噬和細(xì)胞凋亡是同時(shí)存在的，相互聯(lián)系與相互制約，自噬性細(xì)胞死亡參與了缺血損傷后神經(jīng)組織的損害［8］。本研究的結(jié)果可推測(cè)出補(bǔ)陽(yáng)還五湯與自噬抑制劑3-MA 干預(yù)后，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞自噬產(chǎn)生促進(jìn)作用，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，另外對(duì)自噬引起神經(jīng)細(xì)胞死亡進(jìn)行抑制。本研究結(jié)果還提示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯與自噬抑制劑3-MA（P＜0.05）在缺血6h后Beclin1、LC3 和 P62等方面比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組三種自噬蛋白較3-MA組表達(dá)降低，是否可以認(rèn)為補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)優(yōu)于3-MA？觀察組在缺血6 h后電鏡檢測(cè)仍有自噬小體存在，但3-MA組電鏡檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)自噬小體存在，說(shuō)明自噬抑制劑已將細(xì)胞自噬現(xiàn)象已消除，可能不會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞死亡進(jìn)行抑制。SCII后行為學(xué)評(píng)分提示觀察組優(yōu)于3-MA組（詳見(jiàn)表1）。從研究結(jié)果分析，補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)優(yōu)于3-MA組，推測(cè)補(bǔ)陽(yáng)還五湯不僅對(duì)細(xì)胞自噬進(jìn)行抑制，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，還可以對(duì)神經(jīng)細(xì)胞死亡進(jìn)行抑制。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自清代名醫(yī)王清任所著的《醫(yī)林改錯(cuò)》，由生黃芪、川芎、當(dāng)歸尾、地龍、桃仁、紅花、赤芍等7味藥物組成，諸藥合用共奏益氣活血通絡(luò)之功，原本用于氣虛血瘀型中風(fēng)所致半身不遂、口眼歪斜、語(yǔ)言謇澀等癥。目前補(bǔ)陽(yáng)還五湯應(yīng)用于脊髓損傷方面的研究較多，并且取得了較好的療效，如可以改善損傷后組織的缺血和炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞死亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)軸突再生作用，改善損傷后組織水腫等。

通過(guò)研究細(xì)胞自噬的機(jī)制與規(guī)律，給予有效的干預(yù)，充分利用其有利的一面，避免其不利的一面，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于凋亡，為神經(jīng)功能恢復(fù)創(chuàng)造良好的條件。補(bǔ)陽(yáng)還五湯的干預(yù)可能會(huì)對(duì)脊髓缺血再灌注損傷細(xì)胞自噬進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。