一貫煎中川楝子佐制配伍對荷H22肝癌小鼠胃腸消化吸收功能的影響*

★ 余功 李璐 胡橋 崔玉順 楊清躍 謝斌*（江西中醫(yī)藥大學 南昌 330004）

我國屬于肝癌高發(fā)地區(qū)，每年死于肝癌仍有11萬人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%，亟需研發(fā)抗肝癌的有效藥物［1］。中醫(yī)認為肝癌患者臨床表現(xiàn)多有虛陰肝郁。肝體陰而用陽，諸邪蘊積日久，極易耗傷肝陰，造成肝陰虧虛，不能制約亢陽，陽熱壅盛，蘊久而化火，肝郁氣滯則影響氣血運行，釀痰生痰，使氣滯、痰凝、血瘀等病理產(chǎn)物膠結(jié)壅塞于局部，日久則形成腫瘤［2］。故在肝癌的治療中，多強調(diào)疏肝理氣，滋補肝陰［3］。一貫煎為滋陰疏肝代表方，主治肝腎陰虛，血燥氣郁而變生諸證，既能緩解肝陰虛所導致的肝陽上亢、氣滯血瘀，又能能疏泄肝氣，順肝木條達之性，常用于肝癌的臨床治療當中，可改善肝癌患者臨床癥狀，加快腫瘤消退速度，縮短治療療程，還能降低放化療不良反應發(fā)生率，提高患者生活質(zhì)量［4-5］。然本方中滋陰類中藥多甘寒滋膩滋，過量使用常會妨礙脾胃運化功能，導致脾胃不健，消化力薄弱；內(nèi)生濕熱、痰濕，苔膩，多痰，或口中多津，舌潤苔白；多次服用過量時即可能產(chǎn)生副作用，出現(xiàn)胸脘痞悶，或腹脹，食欲不振，大便稀薄或腹瀉，或多痰唾，口中涎膩不爽，舌上多津，舌苔厚膩等。

川楝子性味苦寒，疏泄肝氣，以調(diào)肝木之橫逆，既疏泄肝氣，又順肝木條達之性，且制諸藥滋膩礙胃之弊，為本方中佐制藥，是本方有別于其他滋肝陰諸方的地不同之處。本研究基于前期一貫煎防治肝癌具有良好效果的前期研究成果［6-7］，通過對比研究一貫煎不同配伍對荷H22肝癌小鼠血清胃泌素（GAS）、胃動素（MLT）、膽囊收縮素（CCK）及血清D木糖含量的影響，探索川楝子佐制配伍在一貫煎抗肝癌中的作用，為臨床辨證應用佐制配伍抗腫瘤提供新的思路。

1 材料

1.1 藥物 一貫煎藥物組成為當歸10 g，北沙參10 g，地黃30 g，麥冬10 g，枸杞子12 g，川楝子5 g，購自江西省中醫(yī)院中藥房，中藥飲片經(jīng)江西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室鄧可眾教授鑒定為正品。將以上中藥加10倍量的清水浸泡1 h后煎煮，水沸后以小火煎40 min，過濾；第2次加8倍量的清水煎煮，水沸后小火煎40 min，過濾，合并濾液，常壓濃縮至33.5 mL（即1 mL藥液含生藥2.3 g）。一貫煎不含川楝子組，北沙參10 g，麥冬10 g，當歸10 g，生地黃30 g，枸杞子12 g，常壓濃縮至33.5 mL，灌胃每次0.2 mL。川楝子組：川楝子5 g常壓濃縮至33.5 mL。每次灌胃0.2 mL。將上述藥物冷卻后密封，4℃保存?zhèn)溆?。注射用環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號H32020857）。

1.2 動物和瘤株 SPF級KM小鼠50只，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（蘇）2016-0010。瘤株：小鼠H22肝癌原代細胞，購于ATCC細胞庫（編號36470TM）。本實驗經(jīng)江西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查批準，批準號：JZLLSC2018-0060。

1.3 試劑 胎牛血清（中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所，批號#TBD15HT）；DMEM高糖培養(yǎng)基（北京Solarbio公司，批號20170605）；胃動素（MLT）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號L181119970）；胃泌素（GAS）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號L181113366）；膽囊收縮素（CCK）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號L181113354）；血清D木糖檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號A035）。RIPA組織/細胞裂解液，PMSF（均由北京Solarbio公司提供，批號分別為201704119，20170330）。

1.4 儀器 波長酶標儀（南京德鐵實驗設(shè)備有限公司）；-80℃冰箱（美國Thermo公司）；搖床烘箱（上海福瑪實驗設(shè)備有限公司）；冷凍離心機（北京時代北利離心機有限公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（上海丙林電子科技有限公司）；紫外分光儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 小鼠H22肝癌細胞培養(yǎng)及造模方法 將小鼠H22肝癌細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，用含體積分數(shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。取最佳生長狀態(tài)的小鼠H22肝癌細胞，用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)密度至5×106個/mL。以0.2 mL/只（1×106個細胞/只）的接種量，無菌注入小鼠腹腔進行接種傳代，于接種7～9d，小鼠腹部膨隆，出現(xiàn)腹水，可用于小鼠皮下移植瘤的接種。

2.2 動物模型 制作荷H22肝癌小鼠模型的建立［8］將腹部明顯隆起的腹水瘤小鼠以脫頸法處死，抽出瘤液以無菌生理鹽水稀釋后1 500 r/min離心5min，調(diào)整瘤細胞濃度為5×106個/mL，于小鼠右腋下行皮下無菌接種，接種量為每只0.2 mL/只。接種后第3天在小鼠右腋下接種部位可觸摸到腫瘤硬塊，成瘤率100%。

2.3 動物分組及給藥方法 將小鼠隨機分為模型組、CTX組、一貫煎組、一貫煎不含川楝子組、川楝子組，每組12只。模型組接種24 h后，以0.2 mL/只生理鹽水灌胃；CTX組：接種24 h后，CTX以50 mg/（kg·d）劑量隔日腹腔注射；接種24 h后，分別給一貫煎組，一貫煎不含川楝子組，川楝子組以0.2 mL/只藥物灌胃。造模前2周即開始按設(shè)計劑量灌胃給藥，繼續(xù)給藥2周后，禁食12h后用3%D木糖灌胃，每只0.2 mL。造模結(jié)束后，眼眶取血法取血，3 000 r/min離心10 min，獲得血清，然后處死各組小鼠，取腫瘤組織、胃組織、小腸組織。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測胃黏膜上皮細胞中GAS、MLT、CCK的含量 從-80℃冰箱里取出腫瘤組織，待其解凍后取0.1g，用高溫高壓滅菌過的剪刀將其盡量剪碎，置于高溫高壓滅菌過的1.5 mL離心管中，加入1mL含PMSF的RIPA裂解液，用組織研磨機充分研磨后4℃，12 000 r/min離心20 min；取其上清液，設(shè)立檢測管、空白管、標準管、標準空白管，再分別按照試劑盒說明書要求操作。最后在酶標儀中以450 nm波長測定各孔的A，然后根據(jù)標準孔A繪制標準曲線，按曲線方程計算各樣品濃度值。

2.5 間苯三酚法檢測血清D木糖的含量 -80℃冰箱里取出腫瘤組織，待其解凍后取0.1 g，用高溫高壓滅菌過的剪刀將其盡量剪碎，置于高溫高壓滅菌過的1.5 mL EP管中，加入1mL含PMSF的RIPA裂解液，用組織研磨機充分研磨后4℃，12 000 r/min離心20 min；取其上清液，設(shè)立檢測管、空白管、標準管、標準空白管，再分別按照試劑盒說明書要求正規(guī)操作。最后在紫外分光儀中以450nm波長測定各孔的A，然后根據(jù)標準孔A繪制標準曲線，按曲線方程計算各樣品濃度值。

2.6 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)均用SPSS20.0軟件分析整理，計量資料用（）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 川楝子佐制配伍對荷H22小鼠腫瘤增殖的影響 與模型組比較，CTX組、一貫煎組、川楝子組、一貫煎不含川楝子組瘤重降低（P＜0.01）；與CTX組比較，一貫煎組、川楝子組、一貫煎不含川楝子組瘤重升高（P＜0.01）；與一貫煎組比較，川楝子組、一貫煎不含川楝子組瘤重升高（P＜0.05）。見表1。

表1 川楝子佐制配伍對荷H22小鼠腫瘤增殖的影響（）

表1 川楝子佐制配伍對荷H22小鼠腫瘤增殖的影響（）

注:與模型組比較，*P＜0.01；與CTX組比較，#P＜0.01；與一貫煎組比較，▲P＜0.05。

組別 n 瘤重/g模型組 10 1.934±0.450 CTX組 10 0.392±0.078*一貫煎組 9 0.997±0.051*#川楝子組 10 1.388±0.369*#▲一貫煎不含川楝子組 10 1.408±0.463*#▲

3.2 川楝子佐制配伍對荷H22小鼠血清D木糖、CCK含量的影響 與模型組比較，一貫煎組、川楝子組血清D木糖含量升高（P＜0.01）；與CTX組比較，一貫煎組、川楝子組血清D木糖含量升高（P＜0.05，P＜0.01）；與一貫煎組比較，一貫煎不含川楝子組血清D木糖含量降低（P＜0.01）。

與模型組比較，一貫煎組血清CCK含量升高（P＜0.05）；與CTX組比較，一貫煎組血清CCK含量升高（P＜0.05）；與一貫煎組比較，川楝子組與一貫煎不含川楝子組血清CCK含量降低（P＜0.05）。見表2。

表2 川楝子佐制配伍對荷H22小鼠血清D木糖、CCK的影響（）

表2 川楝子佐制配伍對荷H22小鼠血清D木糖、CCK的影響（）

注:與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與CTX組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與一貫煎組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別 n D木糖/mmol·L-1CCK/pg·mL-1模型組 10 0.469±0.072 83.959±2.301 CTX組 10 0.510±0.149 81.836±8.579#一貫煎組 9 0.707±0.077**## 90.144±7.351*川楝子組 10 0.629±0.113**# 85.04±3.085▲一貫煎不含川楝子組 10 0.563±0.098▲▲ 85.15±2.363▲

3.3 川楝子佐制配伍對荷H22小鼠血清MLT、GAS含量的影響 與模型組比較，一貫煎組血清MLT含量升高（P＜0.01），CTX組血清MLT含量降低（P＜0.05）；與CTX組比較，一貫煎組、川楝子組、一貫煎不含川楝子組血清MLT含量升高（P＜0.05，P＜0.01）；與一貫煎組比較，川楝子組、一貫煎不含川楝子組血清MLT含量降低（P＜0.05）。

與模型組比較，一貫煎組血清GAS含量升高（P＜0.01；與CTX組比較，一貫煎組比較，川楝子組GAS含量升高（P＜0.05，P＜0.01）；與一貫煎組比較，川楝子組、一貫煎不含川楝子組血清GAS含量降低（P＜0.01）。見表3。

表3 川楝子佐制配伍對荷H22小鼠血清MLT、GAS的影響（） pg/mL

表3 川楝子佐制配伍對荷H22小鼠血清MLT、GAS的影響（） pg/mL

注:與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與CTX組比較，#P<0.05，##P<0.01；與一貫煎組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

組別 n MLT GAS模型組 10 1 170.556±108.517 16.412±1.511 CTX組 10 1 012.434±179.106* 14.61±2.677一貫煎組 9 1 369.259±142.267**##23.742±2.428**##川楝子組 101 201.543±180.641##▲17.415±2.343#▲▲一貫煎不含川楝子組10 1 187.955±92.062#▲ 16.394±2.466▲▲

4 結(jié)論

川楝子性寒不燥，既能疏肝泄熱、行氣止痛，又順肝木條達之性， 雖有“苦燥傷陰”之說，但配在滋陰養(yǎng)血為主的方藥中，既可疏肝泄熱、順肝木條達之性，平其橫逆，又能引諸藥直達肝經(jīng)。一貫煎在大量滋陰藥（沙參、麥冬、當歸、生地、構(gòu)杞子）中，使用佐制藥川辣子疏肝理氣，宣泄郁火，使滋而不膩。故清代名醫(yī)張山雷曰：“獨加一味川楝子，以調(diào)肝木之橫逆，能順其條達之性，是為涵養(yǎng)肝陰無上之良藥……口苦而燥，是上焦之郁火，故以川楝泄火，楝本苦燥，而入于大劑養(yǎng)液隊中，反為潤燥之用”，這正是本方有別于其他滋肝陰諸方的不同之點［9］。同時，川楝子性苦寒，可制諸藥滋膩礙胃之弊，為佐制藥。故在本方中，川楝子既為佐助藥，又為佐制藥，從而實現(xiàn)一貫煎補肝與疏肝相結(jié)合，在本方抑制肝癌中發(fā)揮了重要作用。

現(xiàn)代研究表明，川楝子中含有豐富的化學成分，具有驅(qū)蟲、抗肉毒、抗腫瘤、抗病毒、抗菌消炎、抗氧化等諸多方面的藥理作用［10-11］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，川楝素具有抑制腫瘤細胞增生和凋亡的作用。如王鵬研究發(fā)現(xiàn)，川楝素可有效抑制P53+和 P53型人肝癌細胞增殖、誘導其凋亡的作用，且抑制強弱與濃度呈正相關(guān)性［12］。賈英杰教授常用川楝子、延胡索，取金鈴子散之配伍，治療肝癌伴腹痛、腹脹患者，療效顯著［13］。

胃腸激素對消化吸收功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，GAS主要由胃竇和十二指腸G細胞分泌，可刺激消化腺分泌外，促進胃平滑肌的收縮，加強胃腸道運動，MTL能夠興奮平滑肌肌，進一步提高胃腸道收縮力和張力，促進胃腸運動和胃排空。CCK可促進胃酸與膽汁分泌，還可以促膽囊收縮，排出膽汁，促進胰腺腺泡分泌各種消化酶［14］。本研究結(jié)果表明，一貫煎組、川楝子組、一貫煎不含川楝子組均能有效抑制荷H22肝癌小鼠腫瘤增殖，一貫煎組與川楝子組抑瘤效果優(yōu)于一貫煎不含川楝子組，一貫煎能升高荷H22小鼠血清D木糖、CCK、GAS、MLT含量，具有明顯胃腸保護與促進消化吸收功能，單獨使用川楝子亦能升高荷H22小鼠血清D木糖含量，能明顯的促進胃腸消化吸收。該研究結(jié)果提示川楝子佐制配伍可有效提高一貫煎藥物功效，其機制可能與川楝子能疏理肝氣，防止其它滋陰藥物礙胃，促進藥物吸收有關(guān)。