Box-Benhnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化金線蓮中多酚的超聲輔助提取工藝研究*

★ 鄭曉艷 郭月麗（漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 福建 漳州 363000）

金線蓮為蘭科開唇蘭屬（Anoectochilus roxburghii（wall.）Lindl）植物，新鮮或干燥全草入藥［1］，全世界品種超過35種，性喜陰涼、潮濕，大致分布于印度、喜馬拉雅山、東南亞各地，野生植株多生長于人跡罕至的原始生態(tài)的陰濕森林和草叢中。金線蓮株高20-30厘米，葉表面墨綠色，鑲嵌以優(yōu)美的金黃或黃白色條紋，因?yàn)楸环Q作“金線蓮”。它在民間使用范圍較廣，素有“藥王”“金草”“神藥”等美稱。歸肺、肝、腎、膀胱經(jīng)，性平，味甘、淡，具有清熱涼血、祛風(fēng)利濕、解毒、止痛、鎮(zhèn)咳等功效［2］。金線蓮臨床上常用于肝炎、支氣管炎、腎炎、膀胱炎、糖尿病、小兒急驚風(fēng)等疾病的治療［3］。金線蓮的主要化學(xué)成分，包括有黃酮、多糖、多酚、揮發(fā)油、有機(jī)酸、甾體、生物堿等［4］。本課題組對(duì)金線蓮的多糖、總黃酮、多酚提取工藝進(jìn)行了一系列研究，本文闡述了Box-Benhnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化金線蓮中多酚的超聲輔助提取工藝研究。

本研究運(yùn)用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化金線蓮中多酚的超聲輔助提取工藝，以沒食子酸的提取率為指標(biāo)，選取提取溫度、超聲時(shí)間、料液比和乙醇濃度的四因素三水平的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，建立回歸方程，以響應(yīng)面分析法（RSM）［5-6］對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、藥理活性、作用機(jī)制提供一定的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超聲波清洗儀（型號(hào)：KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（型號(hào)：T6，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司公司）；電子分析天平（型號(hào)：BS110S/110g，德國塞多利斯有限公司）。

1.2 材料 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研 究 院，LOT NUMBER：PR190325-11）；Folin-Ciocalteus試劑（三明市三圓化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：2018080709）；乙醇（三明市三圓化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：2018030109）所用試劑均為分析純。金線蓮（購于廈門涌泉科技有限公司，經(jīng)三明市食品藥品檢驗(yàn)鑒定研究院中藥室高忠坂中藥師鑒定為正品）

2 方法

2.1 金線蓮中多酚的超聲輔助提取工藝 準(zhǔn)確稱取5.0g的干燥的金線蓮樣品置于具塞錐形瓶中，按料液比加入一定濃度的乙醇溶液，在一定的提取溫度超聲處理一定時(shí)間，冷卻至室溫，稱重，加乙醇溶液補(bǔ)足減失重量，過濾，收集續(xù)濾液測定其多酚提取量。

2.2 多酚含量測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.100 g至100 mL容量瓶，乙醇定容至刻度線，得到1mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密量取1 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，乙醇稀釋至100 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。分別量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，按1∶9比例加入Folin-Ciocalteus試劑［7］，再加乙醇使得終體積為2.5 mL。搖勻振蕩3min后加入1%Na2CO3溶液1.5 mL，室溫下避光靜置1 h，于760 nm波長測定其吸光度，以沒食子酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=21.786X+0.0003，r=0.9991。

2.2.2 金線蓮中多酚提取量的計(jì)算［8］精密吸取樣品溶液0.5 mL，按1∶9比例加入Folin-Ciocalteus試劑，搖勻振蕩3 min后加入1.5 mL1%Na2CO3溶液，室溫下避光靜置1 h，以乙醇溶液為參比液，于760 nm波長測定其吸光度。按下式計(jì)算樣品中多酚的提取量：

多酚提取量（mg/g）=C×D/m

式中，C為回歸方程計(jì)算得到的沒食子酸含量（mg/mL）；D為稀釋倍數(shù)；m為稱取金線蓮樣品的質(zhì)量（g）。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別考察提取溫度、超聲時(shí)間、料液比和乙醇濃度等4個(gè)單因素對(duì)金線蓮中多酚提取量的影響。

2.3.1 提取溫度對(duì)多酚提取量的影響 稱取干燥的金線蓮樣品，按1∶40料液比加入體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液，分別于提取溫度20、30、40、50、60、70℃超聲提取60min，測定提取液中多酚提取量。

2.3.2 超聲時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響 稱取干燥的金線蓮樣品，按1∶40料液比加入體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液，分別超聲提取20、40、60、80、100、120 min，設(shè)定提取溫度為50℃，測定提取液中多酚提取量。

2.3.3 料液比對(duì)多酚提取量的影響 稱取干燥的金線蓮樣品，分別以料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶45加入體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液，設(shè)定提取溫度為50℃，超聲提取60 min，測定其提取液中多酚提取量。

2.3.4 乙醇濃度對(duì)多酚提取量的影響 稱取干燥的金線蓮樣品，按1∶40料液比加入體積分?jǐn)?shù)分別為0%、10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液，設(shè)定提取溫度為50℃，超聲提取60 min，測定其提取液中多酚提取量。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溫度（X1）、超聲時(shí)間（X2）、料液比（X3）和乙醇濃度（X4）為因素，金線蓮中沒食子酸提取率為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平表

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 稱取干燥的金線蓮藥材3份，按照最佳工藝條件進(jìn)行提取，按照“2.1項(xiàng)金線蓮中多酚的超聲輔助提取工藝”，按“2.2多酚含量測定”項(xiàng)測定金線蓮中多酚含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 提取溫度對(duì)多酚提取量的影響 見圖1，結(jié)果顯示，金線蓮中多酚提取量隨著提取溫度升高有一定程度的增加，當(dāng)提取溫度為50℃時(shí)，其提取量最大；之后提取量逐漸下降。因此，選擇提取溫度設(shè)定為50℃。

圖1 提取溫度對(duì)金線蓮中多酚提取量的影響

3.1.2 超聲時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響 見圖2，結(jié)果顯示超聲時(shí)間較短時(shí)，金線蓮中多酚提取量較小，可能時(shí)間較短不利于金線蓮中多酚的提取。隨著超聲時(shí)間的增加，多酚提取量增加；當(dāng)時(shí)間為60 min時(shí)，提取效果最好。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)金線蓮中多酚提取量的影響

3.1.3 料液比對(duì)多酚提取量的影響 見圖3，結(jié)果顯示低濃度的料液比可能使金線蓮中多酚提取不充分，提取量較??；隨著料液比的增加，多酚的提取量逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，提取量最大。

圖3 料液比對(duì)金線蓮中多酚提取量的影響

3.1.4 乙醇濃度對(duì)多酚提取量的影響 見圖4，結(jié)果顯示不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)多酚的提取有不同程度的影響；體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇濃度對(duì)金線蓮中多酚有較好的提取量。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)金線蓮中多酚提取量的影響

3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合設(shè)計(jì)原理，采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2。

表2 金線蓮中多酚提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

（續(xù)表）

對(duì)上表中金線蓮中多酚提取率（Y）及三個(gè)因素X1、X2、X3和X4的數(shù)值由Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行二次回歸模型擬合，回歸分析結(jié)果分別見表3。

表3 金線蓮中多酚（Y）模型的顯著性檢驗(yàn)及方差分析

對(duì)表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到的二元多項(xiàng)回歸方程為：

R=5.251-0.132 8A-0.062 4B+0.123 7C-0.055 8D-0.000 683AB-0.000 623AC+0.000 181AD+0.001 56B C+0.000 359BD-0.000 033 8CD+0.001 97A2+0.000 279B2-0.002 35C2+0.000 586D2

回歸方程中個(gè)變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性用F 檢驗(yàn)來判定，概率P值小于0.05為有顯著性差異，小于0.01為有極顯著性差異。由表3分析結(jié)果看，整體模型的P＜0.05，表明該二次方程模型顯著。而且方程的失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明非試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不大，可用于金線蓮中多酚提取實(shí)驗(yàn)預(yù)測。因素B，D，BC，C2，D2為顯著影響因素，影響大小順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞乙醇濃度＞提取溫度＞料液比。兩兩因素之間的交互作用中，超聲時(shí)間和料液比的交互作用對(duì)金線蓮中多酚提取效果影響顯著。金線蓮中多酚提取的等高線圖與響應(yīng)面3D圖譜見圖5。

圖5 提取時(shí)間與料液比對(duì)金線蓮中多酚的響應(yīng)面及等高線圖

由結(jié)果可知，模型的校正決定系數(shù)RAdj2為0.991 0，表明此模型能解釋99.10% 響應(yīng)值的變化，即此模型與數(shù)據(jù)擬合度較高，實(shí)驗(yàn)誤差影響較小。說明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化的金線蓮中多酚提取工藝準(zhǔn)確可靠。

3.3 最佳提取工藝 根據(jù)Expert 8.0.6軟件分析結(jié)果，金線蓮中多酚的最佳提取工藝為：提取溫度42.51℃，超聲超聲時(shí)間72.14 min，料液比為1∶40.02，乙醇濃度為49.77%，此條件下金線蓮中多酚提取率預(yù)測值為2.92 mg/g。

3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為確保該工藝的穩(wěn)定性與合理性，根據(jù)響應(yīng)面法得出的最佳提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證（n=3），按照2.1項(xiàng)方法制備供試品溶液，測定金線蓮中多酚含量。為方便實(shí)驗(yàn)具體操作，將提取溫度設(shè)定為43℃，超聲超聲時(shí)間72min，料液比為1∶40，乙醇濃度為50%。實(shí)際測得金線蓮中多酚平均提取量為2.89 mg/g，與理論預(yù)測值（2.92 mg/g）相比無顯著性差異（P＞0.05）。因此，采用Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化的金線蓮中多酚提取工藝條件穩(wěn)定可行，準(zhǔn)確可靠。

4 小結(jié)與討論

（1）本研究采用響應(yīng)面法［9］（Design-Expert軟件）考察金線蓮中多酚的提取工藝，并且根據(jù)二次方程模型分別做出了試驗(yàn)因素間交互作用的三維立體響應(yīng)曲面和等高線圖。結(jié)果顯示，二次方程的模擬回歸差異顯著，失擬項(xiàng)不顯著，表明實(shí)驗(yàn)建立的二次回歸方程能較好地反映考察因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理。

（2）本實(shí)驗(yàn)首先通過單因素試驗(yàn)分析不同因素對(duì)金線蓮中多酚提取量的影響，確定了合適的提取條件；再根據(jù) Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以金線蓮中多酚提取量為響應(yīng)值，提取溫度（X1）、超聲時(shí)間（X2）、料液比（X3）和乙醇濃度（X4）為因素為影響因素設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。通過對(duì)響應(yīng)值結(jié)果分析，獲得金線蓮中多酚最佳提取工藝為：提取溫度43℃，超聲超聲時(shí)間72 min，料液比為1∶40，乙醇濃度為50%。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，與模型預(yù)測值基本相符，證明了該工藝的可行性。

（3）超聲輔助提取金線蓮多酚工藝操作簡單，提取時(shí)間較短；超聲波能較好地?fù)羝浦兴幉牡募?xì)胞壁，有利于有效成分的溶出；提取過程化學(xué)試劑使用量較少，減少試劑的污染；即具有高效、省時(shí)、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。該提取工藝可為金線蓮多酚的進(jìn)一步開發(fā)利用研究提供科學(xué)依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。