復(fù)方馬紅散中羥基紅花黃色素A與ZnO的含量測定方法研究

王昭懿 陳揚(yáng) 鄒秦文 顧念念 趙霞 孟雪丹 馮丹 梁瑞強(qiáng) 林瑞超 高達(dá)欣

摘要?目的：針對(duì)復(fù)方馬紅散中具有抗炎、收濕止癢功效的兩味中藥紅花和爐甘石，分別建立快速、高效、準(zhǔn)確的高效液相色譜法及紫外-可見光分光光度法以測定其中羥基紅花黃色素A和ZnO的含量，為復(fù)方馬紅散的質(zhì)量控制提供保障、為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。方法：羥基紅花黃色素A的含量測定采用Waters XSelect HSS T3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫設(shè)置為30 ℃，以乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77）為流動(dòng)相等度洗脫，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，在403 nm波長下檢測。以鋅試劑為顯色劑，采用改良的紫外-可見光分光光度法在620 nm下測定ZnO的含量。結(jié)果：15批復(fù)方馬紅散樣品中羥基紅花黃色素A的含量范圍為8.61～15.31 mg/g。15批復(fù)方馬紅散樣品中ZnO的含量范圍為82.67～149.40 mg/g。結(jié)論：本文基于2020版《中華人民共和國藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)羥基紅花黃色素A、ZnO的含量測定方法進(jìn)行了一定的優(yōu)化，經(jīng)方法學(xué)考察，所建立的含量測定方法能快速、準(zhǔn)確地測定復(fù)方馬紅散中羥基紅花黃色素A、ZnO的含量，對(duì)其質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定有一定的參考意義。

關(guān)鍵詞?羥基紅花黃色素A;ZnO;高效液相色譜法;紫外-可見光分光光度法;含量測定;復(fù)方馬紅散

Abstract?Objective：To establish fast，efficient and accurate high performance liquid chromatography（HPLC）methods and UV-Vis spectrophotometry methods to determine the content of hydroxysafflor yellow A and ZnO of Carthamus tinctorius L.and to provide guarantee for the quality control and reference for the establishment of quality standards of Fufang Mahong Powder，and Calamine in Fufang Mahong Powder，which have anti-inflammatory，removing dampness and antipruritic effects.Methods：A Waters XSelect HSS T3 column（250 mm × 4.6 mm，5 μm）was used for the determination of hydroxysafflor yellow A.The column temperature was 30 ℃.Acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution（23∶77）was used as the mobile phase，and the flow rate was 1 mL/min.The injection volume was 20 μL.The detection wavelength was 403 nm.The zinc reagent was used as the chromogenic reagent，and a modified UV-Vis spectrophotometry was used to determine the content of ZnO at 620 nm.Results：The content of hydroxysafflor yellow A was 8.61-15.31 mg/g in 15 batches of Fufang Mahong Powder.The content of ZnO was 82.67-149.40 mg/g in 15 batches of Fufang Mahong Powder.Conclusion：The determination methods of hydroxysafflor yellow A and ZnO have been optimized based on the Chinese Pharmacopoeia（2020 edition）and related literature.Their Hydroxysafflor yellow A; ZnO content of Fufang Mahong Powder can be quickly and accurately determined by the established methods with confirmed methodology.This study has a certain reference significance for the quality control and the establishment of quality standards of Fufang Mahong Powder.

Keywords?Hydroxysafflor yellow A; ZnO; High performance liquid chromatography; UV-Vis spectrophotometry; Content determination; Fufang Mahong Powder

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.010

復(fù)方馬紅散是北京泰康園醫(yī)學(xué)研究院研究并開發(fā)的院內(nèi)制劑，其對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有較好療效[1]。其藥味組成之一的紅花是菊科植物Carthamus tinctorius L.的干燥花[2]，具有通經(jīng)活絡(luò)、活血化瘀等功效，紅花中所含的羥基紅花黃色素A是其活血化瘀的主要有效成分[3]，其可以通過激活BK Ca通道并抑制L型Ca通道來誘導(dǎo)血管舒張[4]，并能制JAK2/STAT1通路從而對(duì)心肌缺血再灌注損傷、缺血性腦灌注等產(chǎn)生治療效果[5-6]。除此之外，羥基紅花黃色素A同時(shí)也具有抗炎、抗氧化等作用，其能抑制MAPK、TNFR1/NF-κB等信號(hào)通路，來降低細(xì)胞炎性反應(yīng)因子的表達(dá)[7-9]，因此羥基紅花黃色素A可能為復(fù)方馬紅散治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的活性成分之一[10]。

爐甘石為碳酸鹽類礦物方解石族菱鋅礦，主含碳酸鋅（ZnCO3），可解毒明目退翳，收濕止癢斂瘡，用于目赤腫痛、瞼弦赤爛、翳膜遮睛、胬肉攀睛、潰瘍不斂、膿水淋漓、濕瘡瘙癢[2]。爐甘石需經(jīng)過煅制、水飛變?yōu)殪褷t甘石入藥，經(jīng)過炮制其主要成分由ZnCO3變?yōu)閆nO[11]，且爐甘石中ZnO的含量影響其抗菌活性[12]。因此，爐甘石所含的ZnO可能也是復(fù)方馬紅散的有效成分之一。

目前對(duì)于復(fù)方馬紅散中羥基紅花黃色素A、ZnO的含量測定方法及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚不明確。本實(shí)驗(yàn)首次建立了復(fù)方馬紅散中羥基紅花黃色素A、ZnO的含量測定方法，并通過該方法測定了15批復(fù)方馬紅散樣品中羥基紅花黃色素A及ZnO的含量，以期為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考和依據(jù)。

1?儀器與試藥

1.1?儀器

電子分析天平（梅特勒-托利多公司，瑞士，型號(hào)：MS105DU）;醫(yī)用數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-250DE）;高效液相色譜儀（包括2695四元梯度泵，在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，2998 PDA紫外檢測器，Empower 3.0色譜工作站，沃特世科技（上海）有限公司，美國，型號(hào)：2695型）;Waters XSelect HSS T3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）[沃特世科技（上海）有限公司，美國，型號(hào)：XSelect HSS T3];雙光束紫外可見分光光度計(jì)（日立高新技術(shù)公司，日本，型號(hào)：UH5300型）;雷磁pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：PHS-3C）;大容量低溫離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司，型號(hào)：GTR10-2）。

1.2?試劑

甲醇為分析純（北京化工廠，批號(hào)：20180622）;乙腈和磷酸均為色譜純（美國Fisher公司）;水為去離子水;鹽酸為分析純（北京化工廠，批號(hào)：20180901）;硼酸為分析純（北京化工廠，批號(hào)：20180216）;氯化鉀為分析純（北京化工廠，批號(hào)：20170801）;氫氧化鈉為分析純（北京化工廠，批號(hào)：20171106）;鋅試劑為分析純（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20180223）;鋅試液（自行配制：取鋅試劑0.13 g，加氫氧化鈉試液2 mL溶解，加水定容至100 mL）;羥基紅花黃色素A對(duì)照品（批號(hào)：PS0325-0025，純度>98%）購自成都普思生物科技有限公司;ZnO對(duì)照品（批號(hào)：111619-200301）購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3?分析樣品

實(shí)驗(yàn)所用各批次樣品由北京泰康園醫(yī)學(xué)研究院提供。

2?方法與結(jié)果

2.1?高效液相色譜法

2.1.1?色譜條件?采用Waters XSelect HSS T3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫為30 ℃;以乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77）為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，流速設(shè)為1.0 mL/min;檢測波長為403 nm;進(jìn)樣量為20 μL。

2.1.2?對(duì)照品溶液的制備?取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，精密稱定，加25%甲醇制成每1 mL含0.13 mg的溶液，即得。

2.1.3?供試品溶液的制備?取本品粉末約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入25%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，4 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.1.4?線性關(guān)系考察?精密移取不同體積的對(duì)照品溶液，分別置25 mL容量瓶中，用25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成不同濃度的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣測定其峰面積。以各濃度對(duì)照品溶液中羥基紅花黃色素A的含量X（μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析。如表1所示，羥基紅花黃色素A在0.087～1.30 μg范圍內(nèi)線性良好。

2.1.5?精密度試驗(yàn)?取同一份樣品溶液，連續(xù)測定六次，記錄峰面積，以六次峰面積分別計(jì)算樣品含量，再計(jì)算RSD值。經(jīng)計(jì)算，RSD為0.49%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.6?供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)?取同一份供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8、10、12、18、24 h進(jìn)樣分析，測定峰面積，分別計(jì)算出樣品含量，再計(jì)算RSD值。計(jì)算得RSD為1.45%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7?重復(fù)性試驗(yàn)?取同一批次樣品，平行制備六份供試品溶液，以六個(gè)峰面積值分別計(jì)算含量，再計(jì)算RSD值。經(jīng)計(jì)算RSD為1.96%（n=6），表明重復(fù)性良好。

2.1.8?回收率試驗(yàn)?取同一批已知含量的復(fù)方馬紅散樣品6份，每份約0.05 g，精密稱定，分別精密加入羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，并計(jì)算加樣回收率和RSD值。由表2可知，六次加樣回收試驗(yàn)的平均回收率為103.33%，RSD為1.18%，表明方法準(zhǔn)確、可靠。

2.1.9?樣品測定結(jié)果?取各批次復(fù)方馬紅散，每批次平行制備兩份供試品溶液，每份供試品溶液分別進(jìn)樣兩次，測定峰面積，計(jì)算各批次樣品中羥基紅花黃色素A的含量。供試品溶液色譜圖如圖1所示，各批次樣品含量見表3。

2.2?紫外-可見光分光光度法

2.2.1?空白試液的制備?精密吸取5 mL稀鹽酸，置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度。

2.2.2?陰性對(duì)照液的制備?稱取不含爐甘石的復(fù)方馬紅散陰性樣品約0.08 g，精密稱定，精密加入20 mL稀鹽酸，振搖，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）5 min使樣品溶解，4 000 r/min，離心半徑28.94 cm，離心10 min，精密吸取5 mL上清液，置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度線。

2.2.3?對(duì)照品溶液的制備?稱取ZnO對(duì)照品8.38 mg，置于100 mL容量瓶中，精密加入5 mL稀鹽酸，振搖使溶解，加水定容至刻度線。

2.2.4?供試品溶液的制備?稱取0.1 g復(fù)方馬紅散各批次樣品，精密稱定，精密加入20 mL稀鹽酸，振搖，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）5 min使樣品溶解，4 000 r/min，離心半徑28.94 cm，離心10 min，精密吸取5 mL上清液，置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度線。

2.2.5?顯色與測定?精密吸取空白溶液、陰性對(duì)照液、對(duì)照品溶液、供試品溶液各2 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，精密加入10 mL硼酸-氯化鉀緩沖液（pH值9.0）及3 mL鋅試液，加水定容至刻度，搖勻，于620 nm處測定吸光度。

2.2.6?專屬性試驗(yàn)?對(duì)陰性對(duì)照液及供試品溶液進(jìn)行全波長掃描。圖2為供試品溶液（綠色）與陰性對(duì)照液（藍(lán)色）的全波長掃描圖。由圖可知，供試品溶液的最大吸收波長為620 nm，在該波長下，復(fù)方馬紅散中其他成分對(duì)ZnO的檢測無干擾，因此選擇此波長作為檢測波長。

2.2.7?線性關(guān)系考察?精密移取不同體積的ZnO對(duì)照品溶液，分別置于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，配制成不同濃度的對(duì)照品溶液，分別于620 nm處測定其吸光度。以ZnO濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析。由表4可知，ZnO在0.67～2.01 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.8?精密度試驗(yàn)?取同一份供試品溶液，連續(xù)測定六次，記錄吸光度值，以吸光度值分別計(jì)算ZnO含量，再計(jì)算RSD值。經(jīng)計(jì)算，ZnO含量的RSD為0.10%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.9?供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)?取同一份供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8 h測定吸光度值，計(jì)算樣品中ZnO含量，再計(jì)算RSD值。計(jì)算得RSD為1.44%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.10?重復(fù)性試驗(yàn)?取同一批次樣品，平行制備6份供試品溶液，以吸光度值分別計(jì)算ZnO含量，再計(jì)算RSD值。經(jīng)計(jì)算，RSD為1.10%（n=6），表明重復(fù)性良好。

2.2.11?回收率試驗(yàn)?稱取已知含量的某一批次復(fù)方馬紅散樣品6份，每份約0.05 g，精密稱定，分別精密加入適量ZnO對(duì)照品，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下方法顯色并檢測，計(jì)算加樣回收率和RSD值。由表5可知，六次加樣回收試驗(yàn)的平均回收率為99.93%，RSD為0.78%，表明方法準(zhǔn)確、可靠。

2.2.12?樣品測定結(jié)果?取15批復(fù)方馬紅散樣品，各批次按“2.2.4”項(xiàng)下方法平行制備兩份供試品溶液，每份供試品溶液按“2.2.5”項(xiàng)下方法測定兩次，記錄吸光度值，計(jì)算各批次樣品中ZnO的含量。樣品含量測定見結(jié)果表6，各批次樣品中ZnO含量范圍為82.67～149.40 mg/g。

3?討論

2020版《中華人民共和國藥典》[2]對(duì)紅花中羥基紅花黃色素A的含量測定項(xiàng)規(guī)定采用甲醇-乙腈-0.7%磷酸（26∶2∶72）作為流動(dòng)相。然而此方法中磷酸的濃度較高，比較容易堵塞色譜柱，損壞儀器，因此本研究采用了乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77）作為流動(dòng)相，可以實(shí)現(xiàn)羥基紅花黃色素A與其他成分的有效分離，能夠完成其含量測定。由于復(fù)方馬紅散中含有一些極性較小的成分，所以實(shí)驗(yàn)前期嘗試采用常壓或減壓過濾方式過濾藥液，但是均導(dǎo)致提取液的大量損失。因此后續(xù)采用離心的方式分離藥液。采用本方法制樣并進(jìn)行測定，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，樣品出峰較快，精密度、重復(fù)性、回收率試驗(yàn)的RSD均能滿足測定要求。通過所建立的含量測定方法對(duì)15批復(fù)方馬紅散中羥基紅花黃色素A的含量進(jìn)行測定，15批復(fù)方馬紅散中羥基紅花黃色素A的含量范圍是8.61～15.31 mg/g。

2020版《中華人民共和國藥典》[2]中，采用絡(luò)合滴定法對(duì)爐甘石中ZnO的含量進(jìn)行測定，但該法的樣品前處理較為繁瑣，滴定終點(diǎn)不易判斷，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)操作水平要求較高。此外，復(fù)方馬紅散中所含的紅花顏色較深，制成供試品溶液后會(huì)干擾滴定終點(diǎn)的判斷，因此采用絡(luò)合滴定法難以實(shí)現(xiàn)其中ZnO的含量測定。經(jīng)過查閱文獻(xiàn)，作者發(fā)現(xiàn)已有采用紫外-分光光度法對(duì)爐甘石藥材、飲片、洗液或其他制劑中ZnO進(jìn)行含量測定的報(bào)道[13-17]。但已報(bào)道文獻(xiàn)中[13-17]，供試品溶液的制備均需要三次的定容步驟才可進(jìn)行最終測定，且采用濾紙分離藥液與藥渣有一定的損失。作者經(jīng)過改良設(shè)計(jì)，以離心代替過濾，將三次定容改為兩次定容，從而有效地減少了前處理過程中供試品的損失、提高了供試品溶液制備的效率、增強(qiáng)了方法的準(zhǔn)確性與重復(fù)性。此方法經(jīng)過方法學(xué)考察，具有良好的專屬性、準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性?；谝呀⒌姆椒?，測得15批次復(fù)方馬紅散樣品中ZnO含量在82.67～149.40 mg/g。實(shí)驗(yàn)中顯色步驟所用的鋅試液需現(xiàn)配現(xiàn)用、避光保存;顯色后的對(duì)照品及供試品溶液也需避光保存、盡快測定。

4?結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)羥基紅花黃色素A和ZnO的含量測定方法進(jìn)行了一定的優(yōu)化。經(jīng)各項(xiàng)方法學(xué)考察驗(yàn)證，所建立的2種含量測定方法可分別用于復(fù)方馬紅散中羥基紅花黃色素A、ZnO含量的測定，可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同批次復(fù)方馬紅散樣品的質(zhì)量控制，對(duì)復(fù)方馬紅散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立有一定的參考價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1]喬婷婷，劉圣金，林瑞超，等.含礦物類中藥外用制劑的藥理毒理作用研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥，2015，17（9）：885-891.

[2]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020.

[3]趙明波，鄧秀蘭，王亞玲，等.高效液相色譜法測定紅花中的羥基紅花黃色素A[J].色譜，2003，（6）：593-595.

[4]Wang N，He DM，Zhou YQ，et al.Hydroxysafflor yellow A actives BK Ca channels and inhibits L-type Ca channels to induce vascular relaxation[J].Eur J Pharmacol，2020，870：172873-172903.

[5]Xu H，Liu TL，Wang WJ，et al.Proteomic Analysis of Hydroxysafflor Yellow A Against Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury in Rats[J].Rejuvenation Res，2019，22（6）：503-512.

[6]Zhou DL，Ding TT，Ni B，et al.Hydroxysafflor Yellow A mitigated myocardial ischemia/reperfusion injury by inhibiting the activation of the JAK2/STAT-1 pathway[J].Int J Mol Med，2019，44（2）：405-416.

[7]Zheng M，Guo XJ，Pan RY，et al.Hydroxysafflor Yellow A Alleviates Ovalbumin-Induced Asthma in a Guinea Pig Model by Attenuateing the Expression of Inflammatory Cytokines and Signal Transduction[J].Front Pharmacol，2019，10：328-339.

[8]劉金連，王海芳，馬淑惠，等.羥基紅花黃色素A通過抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中TNFR1/NF-κB信號(hào)通路而發(fā)揮抗炎作用[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2015，31（7）：945-948.

[9]陳夢，趙丕文，孫艷玲，等.紅花及其主要成分的藥理作用研究進(jìn)展[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2012，5（7）：556-560.

[10]鄭福增，范圍，孟慶良，等.紅花注射液對(duì)活動(dòng)期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎纖維蛋白原及D-二聚體的影響[J].河南中醫(yī)，2018，38（10）：1594-1598.

[11]張杰紅，施學(xué)驕，韋正，等.爐甘石炮制前后成分分析及熱穩(wěn)定性[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（24）：16-18.

[12]郭義明.納米中藥的制備及性能研究[D].長春：吉林大學(xué)，2006：48-57.

[13]周建林.紫外可見分光光度法測定爐甘石洗劑中氧化鋅的含量[J].中國醫(yī)藥指南，2014，12（13）：48-49.

[14]楊連菊，馮學(xué)鋒，徐子芳，等.爐甘石藥材及飲片中氧化鋅紫外-可見測定方法研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（22）：89-91.

[15]楊連菊.分光光度法測定爐甘石制劑中氧化鋅的含量[C].2010中藥炮制技術(shù)、學(xué)術(shù)交流暨產(chǎn)業(yè)發(fā)展高峰論壇論文集.成都：中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)，2010：312-314.

[16]楊連菊.分光光度法測定爐甘石藥材及飲片中氧化鋅的含量[C].2010中藥炮制技術(shù)、學(xué)術(shù)交流暨產(chǎn)業(yè)發(fā)展高峰論壇論文集.成都：中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)，2010：309-311.

[17]聶秀霞，曾文雪，莫國棟，等.紫外-可見分光光度法測定氯霉素爐甘石洗劑中氧化鋅的含量[J].江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，26（1）：70-72.

（2020-06-10收稿?責(zé)任編輯：徐穎）