葒草中6種活性成分在正常和心肌缺血模型大鼠體內(nèi)的腸吸收特征差異研究

潘潔 楊淑婷 孫佳 劉春花 王永林 陸苑

摘 要 目的：研究葒草中6種活性成分（葒草素、異葒草素、牡荊素、原兒茶酸、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷）在正常和心肌缺血模型大鼠體內(nèi)的腸吸收特征差異。方法：采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大鼠腸循環(huán)灌流液中6種活性成分的含量。將80只雄性SD大鼠分為正常組和模型組，每組40只，模型組大鼠皮下注射鹽酸異丙腎上腺素（50 mg/kg）復(fù)制心肌缺血模型，正常組大鼠注射等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)注射2 d。造模成功24 h后，取正常組和模型組大鼠腸段進行在體腸循環(huán)灌流實驗。分別考察葒草提取物不同質(zhì)量濃度（5.0、10.0、20.0 mg/mL）、不同腸段（十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸）、P-糖蛋白（P-gp）抑制劑（鹽酸維拉帕米）和膽汁對各成分腸吸收的影響。結(jié)果：葒草素、異葒草素、牡荊素、原兒茶酸、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷和槲皮苷的質(zhì)量濃度線性范圍分別為3.15～50.40 、3.21～51.31、1.63～52.43 、1.60～50.94、1.31～20.97、8.07～129.25 ?g/mL（r均大于0.999），定量限分別為7.86、8.45、6.52、4.00、3.28、16.14 ng/mL，精密度、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性試驗的RSD均小于11%，準確度為85.64%～107.65%，符合生物樣品定量分析要求。除模型組大鼠十二指腸中葒草素的吸收在不同質(zhì)量濃度下無顯著性差異外，其余5種成分在正常和模型大鼠十二指腸的吸收均隨活性成分質(zhì)量濃度的升高而增加，且模型組大鼠中質(zhì)量濃度和/或高質(zhì)量濃度活性成分（槲皮苷除外）的吸收顯著少于正常組（P<0.05）。在正常組大鼠中，葒草素主要在空腸、回腸、結(jié)腸吸收較多，異葒草素主要在回腸吸收較多，牡荊素、原兒茶酸主要在空腸、回腸吸收較多，山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷主要在十二指腸、空腸、結(jié)腸吸收較多，槲皮苷主要在結(jié)腸吸收較多;在模型組大鼠中，葒草素主要在空腸、結(jié)腸吸收較多，異葒草素在4種腸段的吸收差別不大，牡荊素主要在回腸吸收較多，原兒茶酸、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷主要在空腸吸收較多，槲皮苷主要在十二指腸、回腸吸收較多;且在同一腸段中，模型組各成分的吸收少于正常組。加入鹽酸維拉帕米后，正常組大鼠中各成分的吸收均增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;模型組大鼠中，葒草素、異葒草素、牡荊素、原兒茶酸和山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷的吸收均顯著增加（P<0.05），槲皮苷吸收也有所增加但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。膽汁流入十二指腸后，正常組大鼠中原兒茶酸的吸收顯著增加（P<0.05）;模型組大鼠中除異葒草素、槲皮苷外，其余各活性成分的吸收均顯著增加（P<0.05）。結(jié)論：葒草中6種活性成分在正常和心肌缺血模型大鼠的全腸段均有吸收，且在病理狀態(tài)下P-gp抑制劑和膽汁可更明顯的促進上述成分的腸吸收。

關(guān)鍵詞 心肌缺血;葒草;活性成分;腸吸收;腸灌流;大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the intestinal absorption differences of 6 kinds of active constituents of Polygonum orientale （kaempferol， isokaempferol， vitexin， protocatechuic acid， kaempferol-3-O-β-D-glucoside and quercetin） in normal and myocardial ischemia （MI） model rats. METHODS： UPLC-MS/MS method was adopted to determine the contents of 6 active components in the intestinal circulatory perfusion fluid. Totally male SD 80 rats were divided into normal group and model group， with 40 rats in each group. Model group was given isoproterenol hydrochloride （50 mg/kg） subcutaneously to induce MI model; normal group was given constant volume of normal saline， once a day， for consecutive 2 days. 24 h after successful molding， normal group and model group received in-situ intestinal circulatory perfusion experiment. The effects of different concentrations of P. orientale extract （5.0， 10.0， 20.0 mg/mL）， different intestinal segments （duodenum， jejunum， ileum， colon）， P-glycoprotein （P-gp） inhibitors （verapamil） and bile on the intestinal absorption of each constituent were explored. RESULTS： The linear ranges of concentrations of kaempferol， isokaempferol， vitexin， protocatechuic acid， kaempferol-3-O-β-D-glucoside and quercetin were 3.15-50.40， 3.21-51.31， 1.63-52.43， 1.60-50.94， 1.31-20.97， 8.07-129.25 ?g/mL（r>0.999）. The lower limits of quantification were 7.86， 8.45， 6.52， 4.00， 3.28， 16.14 ng/mL， respectively. RSDs of precision， matrix effect and stability tests were all lower than 11%; the accuracy were 85.64%-107.65%， which were in line with the requirements of biological sample quantification analysis. Except for there was no statistical significance in the absorption of kaempferol absorption in duodenum of model group at different concentrations， absorption of other five constituents in duodenum of normal and model rats increased with the increase of the concentration of active constituents， and absorption of medium- and/or high- concentration active constituents （except quercetin） in model group was significantly lower than normal group （P<0.05）. In normal group， the absorption of kaempferol was more in jejunum， ileum and colon， isokaempferol was more in ileum， vitexin and protocatechuic acid were more in jejunum and ileum， kaempferin-3-O- β-D-glucoside was more in duodenum， jejunum and colon， quercetin was more in colon; in the model group， the absorption of Polygonum orientale in jejunum and colon was more， the absorption of isokaempferol in 4 intestinal segments was little different， vitexin was mainly absorbed in ileum， protocatechuic acid and kaempferol-3-O-β-D-glucoside was mainly absorbed in jejunum， quercetin was mainly absorbed in duodenum and ileum; in the same intestine， the absorption of constituents in the model group was less than normal group. After adding verapamil， absorption of all constituents in the normal group increased， but the difference was not statistically significant （P>0.05）; absorption of kaempferol， isokaempferol， vitexin， protocatechuic acid and kaempferol-3-O-β-D-glucoside were all increased significantly in model group （P<0.05）， while there was no statistical significance in the increase of quercetin （P>0.05）. After the bile flowed into the duodenum， absorption of protocatechuic acid was increased significantly in normal group （P<0.05）; absorption of other active constituents were increased significantly in model group， except for isokaempferol and quercetin （P<0.05）. CONCLUSIONS： Six active constituents of P. orientale were absorbed in the whole intestine of normal and MI model rats， and the absorption of above constituents may be enhanced more significantly by P-gp inhibitor and bile under pathological condition.

KEYWORDS Myocardial ischemia; Polygonum orientale; Active constituent; Intestinal absorption; Intestinal perfusion; Rat

葒草為蓼科植物葒草（Polygonum orientale L.）的干燥果穗及帶葉莖枝，具有祛風(fēng)除濕、活血消腫的功效，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、冠心病等[1]。相關(guān)研究表明，葒草具有抗急性心肌缺血、增加心肌血流量、抗菌、抗血栓等藥理活性[2]。本課題組前期通過對葒草藥用部位、化學(xué)成分、藥理活性及血清譜效關(guān)系等方面的研究發(fā)現(xiàn)，葒草水溶性部位有較好的抗心肌缺血和抗缺氧作用，其含量較高的活性成分主要為原兒茶酸、異葒草素、葒草素、牡荊素、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷等酚酸類和黃酮類化合物[3]。

口服給藥是中藥常用的臨床給藥方式，中藥經(jīng)口服后主要在胃腸道被吸收，各活性成分進入血液后隨體循環(huán)分布到各個組織器官并發(fā)揮療效。據(jù)研究報道，機體在病理狀態(tài)下，其體內(nèi)藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運蛋白、腸道菌群、細胞膜通透性等較在正常生理狀態(tài)時有所改變，進而影響中藥在機體內(nèi)的吸收過程[4-5]，故研究中藥在病理狀態(tài)下的吸收特征對于闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義。

本研究通過皮下注射大劑量鹽酸異丙腎上腺素制備心肌缺血模型大鼠[6-8]，采用在體腸循環(huán)灌流法研究葒草提取物中6個活性成分（葒草素、異葒草素、牡荊素、原兒茶酸、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷）在不同條件下[不同藥物質(zhì)量濃度、不同腸段、P-糖蛋白（P-gp）抑制劑作用下、膽汁作用下]在正常和心肌缺血模型大鼠體內(nèi)的腸吸收特征差異，從而為葒草體內(nèi)過程的深入研究提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC-TQD型超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）;Allegra 64R型低溫高速離心機（美國Beckman公司）; BT100-2J型恒流泵（保定蘭格恒流泵有限公司）;DK-98-Ⅱ型恒溫水浴鍋（天津泰斯特有限公司）;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）; WP-UP-Ⅱ-20型超純水機（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）;ZH-2型渦旋混合器（天津藥典標準儀器廠）;MTN-2800D型氮吹濃縮裝置（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）;CQ 250A-TS型超聲波清洗機（上海躍進醫(yī)用光學(xué)器械廠）。

1.2 藥品與試劑

葒草藥材購自貴州省盤州市丹霞鎮(zhèn)，由貴州醫(yī)科大學(xué)劉春花副教授鑒定為葒草的帶葉莖枝。葒草素、異葒草素、牡荊素、原兒茶酸、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號分別為：wkq16041301、wkq16080404、wkq16031003、wkq16012105、wkq16022301、wkq16080402，純度：均不低于98%）;葛根素對照品（內(nèi)標，批號：S02M9B54875，純度：≥98%）、鹽酸維拉帕米原料藥（批號：Y05J6C2，純度：≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司;鹽酸異丙腎上腺素原料藥（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：L1708046，純度：≥99%）;水合氯醛（批號：20150110）、葡萄糖（批號：20170923）均購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;無機試劑均為分析純，甲醇為色譜純，水為純凈水。

1.3 動物

SPF級健康SD大鼠，雄性，體質(zhì)量為（250±20） g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2014-0011。大鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2） ℃、相對濕度（60±10）%的環(huán)境中，飼養(yǎng)管理均嚴格按照實驗動物的要求及規(guī)則，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 單一對照品溶液的制備 精密稱取葒草素、異葒草素、牡荊素、原兒茶酸、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷對照品適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成上述6種成分質(zhì)量濃度分別為1.090、1.026、1.048、1.018、0.839、1.034 mg/mL的單一對照品溶液，于-20 ℃保存，備用。

2.1.2 內(nèi)標溶液的制備 精密稱取葛根素對照品適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成葛根素儲備液。取該儲備液適量，用甲醇稀釋制成質(zhì)量濃度為10.40 ?g/mL的內(nèi)標溶液，于-20 ℃保存，備用。

2.1.3 Krebs-Ringers（K-R）營養(yǎng)液的制備 稱取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、NaHCO3 1.37 g、NaH2PO4 0.32 g、MgCl2 0.02 g、CaCl2 0.37 g、葡萄糖1.40 g，除CaCl2和葡萄糖外的其余試劑先用少量水溶解，然后單獨溶解CaCl2后逐滴加入，葡萄糖臨用時加入，全部試劑溶解后用水定容至1 L，備用。

2.1.4 葒草提取物溶液的制備 取葒草藥材適量，按本課題組前期研究方法[3]制備其提取物（得率為5.02%）。分別取葒草提取物適量，加入K-R營養(yǎng)液超聲（功率：300 W，頻率：20 kHz，下同）溶解，濾過，分別制成質(zhì)量濃度為5.0、10.0、20.0 mg/mL的葒草提取物溶液。

2.1.5 空白腸循環(huán)液的制備 取空白K-R營養(yǎng)液，于大鼠小腸段腸道中以1.0 mL/min的流速循環(huán)灌流2 h，制成空白腸循環(huán)液，現(xiàn)用現(xiàn)制。

2.2 樣品預(yù)處理

取腸循環(huán)液樣品300 ?L，置于1.5 mL離心管中，加入內(nèi)標溶液13 ?L、1%甲酸溶液100 ?L，渦旋混合5 s，再用水飽和正丁醇800 ?L萃取1次，渦旋混合1 min，超聲10 min;以12 000 r/min離心10 min，取上清液，于37 ℃條件下N2吹干，用50%甲醇300 ?L超聲10 min復(fù)溶，再以13 000 r/min離心10 min，取上清液進樣分析。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Waters BEH C18（50 mm ×2.1 mm，1.7 ?m），保護柱為Waters Van Guard BEH C18（5.0 mm×2.1 mm，1.7 ?m）;流動相為0.1%甲酸乙腈溶液（A） - 0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～0.5 min，10%A;0.5～3.0 min，19.0%A;3.0～3.5 min，90.0%A;3.5～4.0 min，10%A）;柱溫為30 ℃;流速為0.3 mL/min;進樣量為5 ?L。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源（ESI）;毛細管電壓為3 kV;離子源溫度為150 ℃;去溶劑氣溫度為400 ℃;去溶劑氣為N2，流速為800 L/h;反吹氣為N2，流速為50? ? L/h;碰撞氣為Ar，流速為0.16 mL/min。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為MassLynx V4.1工作站;掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（MRM）。各成分離子對信息見1。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 取空白腸循環(huán)液、混合對照品溶液（取“2.1.1”項下各單一對照品溶液適量混合）、內(nèi)標溶液和葒草提取物腸循環(huán)液（10.0 mg/mL葒草提取物溶液腸循環(huán)1 h）適量，按“2.2”項下方法處理后，再按“2.3”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，葒草素、異葒草素、牡荊素、原兒茶酸、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷和葛根素之間的分離度良好，空白腸循環(huán)液對各成分測定無干擾，詳見圖1。

2.4.2 線性關(guān)系及定量限考察 取葒草素、異葒草素、牡荊素、原兒茶酸、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷單一對照品溶液適量，在37 ℃條件下以N2吹干，用K-R營養(yǎng)液復(fù)溶后逐級稀釋制成葒草素質(zhì)量濃度為3.15、6.30、12.60、25.20、50.40 ?g/mL，異葒草素質(zhì)量濃度為3.21、6.41、12.83、25.65、51.31 ?g/mL，牡荊素質(zhì)量濃度為3.27、6.55、13.11、26.21、52.43 ?g/mL，原兒茶酸質(zhì)量濃度為3.18、6.36、12.73、25.45、50.94 ?g/mL，山柰素-3-O-β- D-葡萄糖苷質(zhì)量濃度為1.31、2.62、5.24、10.48、20.97? ? ?g/mL，槲皮苷質(zhì)量濃度為8.07、16.16、32.31、64.62、129.25 ?g/mL的系列溶液，然后按“2.2”項下方法預(yù)處理后，再按“2.3”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣分析。以待測成分峰面積與內(nèi)標峰面積之比為縱坐標（y）、待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標（x，mg/mL）進行回歸分析。另外，以信噪比為10 ∶ 1計算各待測成分的定量下限。葒草中6種活性成分的回歸方程、線性范圍及定量下限見表2。

2.4.3 準確度和精密度試驗 按“2.1.1”項下方法分別配制6種活性成分的低、中、高質(zhì)量濃度（葒草素3.15、12.60、25.20 ?g/mL，異葒草素3.21、12.83、25.65 ?g/mL，牡荊素3.27、13.11、26.21 ?g/mL，原兒茶酸3.18、12.73、25.45 ?g/mL，山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷1.31、5.24、10.48 ?g/mL，槲皮苷8.07、32.31、64.62 ?g/mL）質(zhì)控樣品溶液，每個質(zhì)量濃度平行制備5份，按“2.2”項下方法預(yù)處理后，再按“2.3”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣分析，考察日內(nèi)精密度;連續(xù)測定3 d，考察日間精密度。將所測得的質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進行比較，考察準確度。結(jié)果，葒草素等6個成分的日內(nèi)和日間精密度試驗RSD均小于9%，準確度為85.64%～107.65%，符合生物樣品定量分析要求。

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)考察 按“2.4.3”項下方法制備葒草素等6種活性成分低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品溶液，于37 ℃條件下以N2吹干，殘渣用空白腸循環(huán)液300 μL復(fù)溶，按“2.2”項下方法預(yù)處理后，再按“2.3”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣分析，記錄峰面積（A1）;另取上述活性成分的低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品溶液，于37 ℃ 條件下以N2吹干，殘渣用初始流動相300 μL復(fù)溶，按“2.2”項下方法預(yù)處理后，再按“2.3”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣分析，記錄峰面積（A2）?；|(zhì)效應(yīng)=A1/A2×100%。每個質(zhì)量濃度樣品均平行操作5次。結(jié)果，基質(zhì)效應(yīng)為87.49%～108.54%，RSD為1.26%～10.12%（n=5），符合生物樣品定量分析要求。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取葒草提取物腸循環(huán)液（10 mg/mL葒草提取物溶液腸循環(huán)1 h），分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時，按“2.2”項下方法預(yù)處理后，再按“2.3”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果，葒草素等6種活性成分峰面積的RSD均小于10%（n=6），表明含藥腸循環(huán)溶液樣品在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 分組與建模

取SD大鼠80只，分為正常組和模型組，每組40只。模型組大鼠皮下注射鹽酸異丙腎上腺素（50 mg/kg，劑量參考相關(guān)文獻[10-12]設(shè)置），每日1次，連續(xù)給藥2 d，復(fù)制心肌缺血模型;正常組大鼠同法注射等量生理鹽水。

2.6 葒草活性成分在大鼠體內(nèi)的腸循環(huán)灌流實驗

大鼠體內(nèi)腸循環(huán)灌流實驗操作步驟參考相關(guān)文獻[9]方法。造模成功24 h后，取正常組和模型組大鼠（已禁食12 h），腹腔注射水合氯醛（0.04 mL/kg）麻醉，然后將大鼠固定于37 ℃恒溫手術(shù)臺上，沿腹部中線打開腹腔，開口約3～4 cm。先結(jié)扎總膽管，然后找到目標腸段（約10 cm），在腸段前、后兩端避開毛細血管分別剪一個小口，插入直徑約0.3 cm的硅膠軟管，并用手術(shù)線固定扎緊，連接恒流泵，使其與恒流泵形成一個回路;再將恒流泵流速調(diào)至1.0 mL/min，并泵入37 ℃ 的生理鹽水沖洗腸道，直至無內(nèi)容物洗出后，排空腸道內(nèi)的水分。取37 ℃恒溫的葒草提取物溶液50 mL至量筒中，并將硅膠軟管插入量筒中，以2.0 mL/min的流速使藥物溶液在目標腸段內(nèi)循環(huán)平衡10 min后，將恒流泵的流速調(diào)節(jié)為1.0 mL/min，并立刻讀出此時量筒內(nèi)藥物溶液體積，然后從量筒中取樣1.0 mL，作為零時間點測定葒草活性成分濃度的樣品;取完樣品后向量筒中補加37 ℃的K-R營養(yǎng)液1.0 mL，繼續(xù)循環(huán)，于不同時間點（10、30、60、90、120 min）按上述方法取樣，同時記錄各時間點補液后量筒內(nèi)葒草提取物溶液體積。末次取樣后，排凈腸道內(nèi)和管路內(nèi)液體并記錄該部分液體體積作為死體積，腸道/管路死體積與各時間點量筒內(nèi)葒草提取物溶液體積之和即為該時間點葒草提取物溶液的體積。然后計算葒草各活性成分腸剩余藥量（Ptn，?g）和灌流2 h的累積吸收轉(zhuǎn)化率（A，%），公式分別為Ptn=ctn×Vtn+1.0×[∑][i=1][n-1]cti，A=（Pt0-Ptn）/Pt0×100%[式中，ctn為tn時間點葒草各活性成分質(zhì)量濃度（?g/mL，根據(jù)按前述超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定）;Vtn為tn時間點葒草提取物溶液體積（mL）;tn為葒草提取物溶液灌注時間（min），Pt0為零時間點各活性成分藥量]。A值越大，則表明該活性成分在腸道中吸收越多。

2.7 葒草中6種活性成分在正常和心肌缺血模型大鼠體內(nèi)的腸吸收特征研究

2.7.1 不同質(zhì)量濃度葒草活性成分在正常和模型大鼠體內(nèi)的腸吸收差異 分別取正常組和模型組大鼠各15只，選取其十二指腸段（幽門往下1.0 cm處起至往下10 cm處），按“2.6”項下方法“在腸段前、后兩端……排空腸道內(nèi)的水分”處理后，分別以不同質(zhì)量濃度（5.0、10.0、20.0 mg/mL）的葒草提取物溶液進行腸循環(huán)灌流實驗（每個質(zhì)量濃度分別用5只正?；蚰Ｐ痛笫筮M行實驗）。于不同時間點取樣，按“2.2”項下方法預(yù)處理后，再按“2.3”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣分析，根據(jù)公式計算A，考察不同質(zhì)量濃度葒草各活性成分在正常和模型大鼠體內(nèi)腸吸收的差異。采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（以下各實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理方法同）。結(jié)果，除模型組大鼠十二指腸中葒草素的吸收在不同質(zhì)量濃度下無顯著性差異外，其余5種成分在正常和模型大鼠十二指腸中的吸收均隨其質(zhì)量濃度的升高而增加，且模型組大鼠十二指腸對中質(zhì)量濃度和/或高質(zhì)量濃度活性成分（槲皮苷除外）的吸收顯著低于正常組（P<0.05），詳見圖2。

2.7.2 葒草活性成分在正常和模型大鼠不同腸段的吸收差異 分別取正常組和模型組大鼠各15只，分為十二指腸段組（即“2.7.1”項下灌流10.0 mg/mL葒草提取物溶液的正常組和模型組大鼠的十二指腸段，因此此腸段不再另取大鼠實驗）、空腸段組（幽門往下15 cm起至往下10 cm處）、回腸段組（盲腸上行 20 cm處起至往下10 cm處）、結(jié)腸段組（盲腸末端起至往下10 cm處），每組5只，按“2.6”項下方法“在腸段前、后兩端……然后排空腸道內(nèi)的水分”處理后，選擇10.0 mg/mL的葒草提取物溶液作為腸循環(huán)灌流液，在上述相應(yīng)腸段處進行循環(huán)灌流實驗。于不同時間點取樣，按“2.2”項下方法預(yù)處理，再按“2.3”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣分析，并根據(jù)公式計算A，考察葒草活性成分在正常和模型大鼠不同腸段的吸收差異。結(jié)果，在正常組大鼠中，葒草素主要在空腸、回腸、結(jié)腸吸收較多，異葒草素主要在回腸吸收較多，牡荊素、原兒茶酸主要在空腸、回腸吸收較多，山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷主要在十二指腸、空腸、結(jié)腸吸收較多，槲皮苷主要在結(jié)腸吸收較多;在模型組大鼠中，葒草素主要在空腸、結(jié)腸吸收較多，異葒草素在4種腸段的吸收差別不大，牡荊素主要在回腸吸收較多，原兒茶酸、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷主要在空腸吸收較多，槲皮苷主要在十二指腸、回腸吸收較多。在同一腸段中，與正常組比較，模型組6種成分在各腸段的吸收均減少：十二指腸對葒草素、牡荊素、原兒茶酸和山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷的吸收，空腸對牡荊素的吸收，回腸對葒草素、異葒草素、牡荊素、原兒茶酸的吸收，結(jié)腸對異葒草素、原兒茶酸、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷的吸收均顯著減少（P<0.05），詳見圖3。

2.7.3 P-gp抑制劑對葒草活性成分在正常和模型大鼠體內(nèi)腸吸收的影響 分別取正常組和模型組大鼠的十二指腸段，每組5只，按“2.6”項下方法“在腸段前、后兩端……然后排空腸道內(nèi)的水分”處理后，選擇10.0 mg/mL的葒草提取物溶液，然后加入P-gp抑制劑鹽酸維拉帕米（0.25 mg/mL）作為腸循環(huán)灌流液，進行腸循環(huán)灌流實驗。于不同時間點取樣，按“2.2”項下方法處理，再按“2.3”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣分析，并按公式計算A，與“2.7.1”項下灌流10.0 mg/mL葒草提取物溶液的正常組和模型組大鼠腸吸收進行比較，考察P-gp抑制劑對葒草活性成分在體內(nèi)腸吸收的影響。結(jié)果，加入鹽酸維拉帕米后，6種成分在正常大鼠十二指腸的吸收均增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;葒草素、異葒草素、牡荊素、原兒茶酸和山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷在模型大鼠十二指腸的吸收均顯著增加（P<0.05），槲皮苷吸收也有所增加但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），詳見圖4。

2.7.4 膽汁對葒草活性成分在正常和模型大鼠體內(nèi)腸吸收的影響 分別取正常組和模型組大鼠的十二指腸段，每組5只，除不結(jié)扎膽管外，按“2.6”項下方法“在腸段前、后兩端……然后排空腸道內(nèi)的水分”處理后，選擇10.0 mg/mL的葒草提取物溶液作為腸循環(huán)灌流液，進行腸循環(huán)灌流實驗。于不同時間點取樣，按“2.2”項下方法預(yù)處理，再按“2.3”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣分析，并按公式計算A，與“2.7.1”項下灌流10.0 mg/mL葒草提取物溶液的結(jié)扎了膽管的正常組和模型組大鼠腸吸收進行比較，考察膽汁對葒草活性成分體內(nèi)腸吸收的影響。結(jié)果，膽汁流入十二指腸后，原兒茶酸在正常大鼠十二指腸的吸收顯著增加（P<0.05），葒草素的吸收增加，其余3種活性成分的吸收減少，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;除異葒草素、槲皮苷外，其余各活性成分在模型大鼠十二指腸的吸收均顯著增加（P<0.05），詳見圖5。

3 討論

基于藥物在體內(nèi)的吸收過程易受到疾病狀態(tài)的影響[4-5]，本研究采用在體腸循環(huán)灌流法，研究葒草中6種活性成分（葒草素、異葒草素、牡荊素、原兒茶酸、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷）在正常和心肌缺血模型大鼠體內(nèi)的腸吸收特征差異。研究結(jié)果顯示，除模型組大鼠十二指腸中葒草素的吸收在不同質(zhì)量濃度下無顯著性差異外，其余5個活性成分在正常和模型大鼠腸段的吸收均隨其質(zhì)量濃度的升高而增加，且模型組大鼠中質(zhì)量濃度和/或高質(zhì)量濃度活性成分（槲皮苷除外）的吸收顯著低于正常組（P<0.05）。在正常組大鼠中，葒草素主要在空腸、回腸、結(jié)腸吸收較多，異葒草素主要在回腸吸收較多，牡荊素、原兒茶酸主要在空腸、回腸吸收較多，山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷主要在十二指腸、空腸、結(jié)腸吸收較多，槲皮苷主要在結(jié)腸吸收較多;在模型組大鼠中，葒草素主要在空腸、結(jié)腸吸收較多，異葒草素在4種腸段的吸收差別不大，牡荊素主要在回腸吸收較多，原兒茶酸、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷主要在空腸吸收較多，槲皮苷主要在十二指腸、回腸吸收較多;且在同一腸段中，模型大鼠中各成分的吸收均低于正常大鼠。加入鹽酸維拉帕米后，正常大鼠中各成分的吸收均增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;模型大鼠中葒草素、異葒草素、牡荊素、原兒茶酸和山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷在十二指腸的吸收均顯著增加（P<0.05），槲皮苷吸收也有所增加但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這提示，大鼠對葒草素等6種活性成分的吸收與灌流藥物的濃度、腸段部位、是否加入P-gp抑制劑有關(guān)。

另外，由于大鼠的生理結(jié)構(gòu)中沒有膽囊，其分泌的膽汁會直接進入十二指腸。膽汁中的主要成分膽汁酸和磷脂類物質(zhì)具有良好的表面活性作用，能夠改善藥物的溶解性能，并通過增加生物膜的通透性促進藥物吸收[10]，因此考察膽汁對葒草各活性成分在正常和模型大鼠腸吸收的影響是有必要的。本研究發(fā)現(xiàn)，未結(jié)扎膽管的正常大鼠，其十二指腸段對原兒茶酸的吸收顯著增加（P<0.05），葒草素的吸收增加，其余3種活性成分的吸收減少，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明膽汁的分泌可促進葒草素、原兒茶酸在正常大鼠十二指腸中的吸收;未結(jié)扎膽管的模型大鼠十二指腸對除異葒草素、槲皮苷外的其余活性成分的吸收均顯著增加（P<0.01），說明在病理狀態(tài)下，膽汁的分泌可促進藥物的吸收。

綜上所述，葒草中6種活性成分在正常和心肌缺血模型大鼠的全腸段均有吸收，且在病理狀態(tài)下P-gp抑制劑和膽汁可更明顯地促進上述各成分的腸吸收。

參考文獻

[ 1 ] 陳思穎，譚丹，朱迪，等.葒草提取物中總黃酮含量測定方法研究[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，39（4）：463-465.

[ 2 ] 張淑賢，管慶霞.葒草的化學(xué)成分及藥理學(xué)研究進展[J].黑龍江醫(yī)藥，2008，21（5）：97.

[ 3 ] 黃勇，鄭林，王愛民，等.葒草不同藥用部位抗心肌缺血作用及化學(xué)成分比較研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21（10）：2520-2522.

[ 4 ] 鞏仔鵬，陳穎，張瑞杰，等.疾病狀態(tài)下的中藥藥代動力學(xué)研究進展[J].中國中藥雜志，2015，40（2）：169-173.

[ 5 ] CHEN WL，LI JJ，SUN ZP，et al. Comparative pharmacokinetics of six coumarins in normal and breast cancer bone-metastatic mice after oral administration of Wenshen Zhuanggu Formula[J]. J Ethnopharmacol，2018. DOI：10. 1016/j.jep.2018.05.031.

[ 6 ] NICHTOVA Z，NOVOTOVA M，KRALOVA E，et al. Mor- phological and functional characteristics of models of experimental myocardial injury induced by isoproterenol[J]. Gen Physiol Biophys，2012，31（2）：141-151.

[ 7 ] GEORGE JC，LINER A，HOIT BD. Isoproterenol-induced myocardial injury：a systematic comparison of subcutaneous versus intraperitoneal delivery in a rat model[J]. Echocardiography，2010，27（6）：716-721.

[ 8 ] YU Y，JIN L，ZHUANG Y，et al. Cardioprotective effect of rosuvastatin against isoproterenol-induced myocardial infarction injury in rats[J]. Int J Mol Med，2018，41（6）：3509-3516.

[ 9 ] 孫慧園，陳浩，梅朝葉，等.白及醇提物中5種主要活性成分的在體腸吸收特征研究[J].中國藥房，2019，30（6）：757-764.

[10] 馬燕，林寶琴，李衛(wèi)中，等.柚皮素大鼠在體腸吸收動力學(xué)的研究[J].中成藥，2012，34（8）：1487-1491.

（收稿日期：2020-03-20 修回日期：2020-04-15）

（編輯：唐曉蓮）