高效液相色譜法測定九葉酒中標(biāo)志性成分淫羊藿苷含量

李婷婷，陳茂欽，張 競，王 倩，王雪芹

（河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450018）

九葉酒是以黃芪、淫羊藿、山茱萸、石斛、生地黃、枸杞、桂圓、大棗、白酒、水為主要原料加工制成的保健酒，具有緩解疲勞、增強(qiáng)免疫力的功能，方中淫羊藿為主要原料。因此，本研究中參考文獻(xiàn)[1 －10]建立了測定九葉酒中淫羊藿苷含量的高效液相色譜(HPLC)法，為該制劑的生產(chǎn)過程及質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Waters2695－2998 型液相色譜儀（沃特世公司）；XPE205 型電子天平（梅特勒公司，精度為十萬分之一）。

試藥：淫羊藿苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110737 －201516，含量為94.2% ）；九葉酒（河南省艾民股份有限公司，批號分別為20181123 －01，20181123－02，20181123－03，20181124－1，20181124－3，20181124－5，20190212－1，20190212－2，20190212－3）；甲醇、乙腈為色譜純（德國Merck 公司）；超純水；甲醇、磷酸二氫鈉、醋酸、磷酸均為分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋成每1 mL 含50 μg 的溶液，即得對照品溶液。精密量取樣品（批號為20181123 －03）2 mL，置25 mL 容量瓶中，并用50%甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過，即得供試品溶液。精密量取不含淫羊藿藥材的陰性樣品2 mL，置25 mL 容量瓶中，并用50%甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過，即得陰性對照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：XSelect?CSH C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈－水（30 ∶70，V／ V）；流速：1.0 mL／min；柱溫：35 ℃；檢測波長：270 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.1 項(xiàng)下3 種溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，詳見圖1。淫羊藿苷峰與相鄰雜質(zhì)峰均能基線分離，表明該方法的專屬性良好。

線性關(guān)系考察：取淫羊藿苷對照品10.97 mg，精密稱定，置20 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液；分別精密量取0.5，1.0，1.0，3.0，2.0 mL，分別置10，10，5，10，5 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.025，0.050，0.100，0.150，0.200 mg ／mL 的線性試驗(yàn)溶液；再取質(zhì)量濃度為0.05，0.10 mg／mL 的線性試驗(yàn)用溶液各1 mL，分別置10 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.005，0.010 mg／mL的線性試驗(yàn)用溶液，搖勻，取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y ＝22 016 X－19 645， r ＝0.999 5。結(jié)果表明，淫羊藿苷質(zhì)量濃度在5.166 9 ～206.674 8 μg ／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：取同一對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果淫羊藿苷峰面積的RSD 為1.01%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為20181123 －03）樣品依法制備供試品溶液，取2 mL 置25 mL 容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制6 份，分別進(jìn)樣計(jì)算含量。結(jié) 果 平 均 含 量 為0.637 mg／mL， RSD 為0.44%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取上述對照品溶液及供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，18，24 h 時(shí)進(jìn)樣測定。結(jié)果淫羊藿苷含量的RSD 分別為1.22%和0.34%，表明待測溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

定量限與檢測限確定：取線性關(guān)系考察項(xiàng)下的質(zhì)量濃度最低的對照品溶液逐級稀釋后測定，按信噪比10 ∶1 為定量限，3 ∶1 為檢測限。結(jié)果表明，本方法定量限為103.34 ng／mL，檢測限為20.67 ng／mL。

加樣回收試驗(yàn)：稱取淫羊藿苷對照品10 mg，精密稱定，置20 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品濃溶液，精密量取1 mL，置10 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。精密量取已知含量的樣品（批號20181123 －03，含量為每100 mL 含63.9 mg）1 mL，平行取9 份，置25 mL 容量瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為0.479 48 mg／mL 的對照品溶液0.7，1.3，2.0 mL（每個(gè)濃度3 份），用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液。取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測定

取9 批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，計(jì)算含量。批號為20181123－01，20181123－02，20181123－03，20181124－1，20181124－3，20181124－5，20190212 －1，20190212 －2，20190212 －3 的 樣 品 中 淫羊藿苷含量分別為每100 mL 含58.8，59.2，63.7，55.1，55.7，69.1，73.2，73.5，73.3 mg。

表1 淫羊藿苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝9）

3 討論

3.1 測定波長選擇

提取淫羊藿苷的HPLC －PDA 圖，顯示淫羊藿苷在269 nm 波長處有最大吸收，故選270 nm 為測定波長。

3.2 流動相選擇

參考文獻(xiàn)[1 －10]，曾分別對乙腈－水[1－6]、乙腈－0.05%磷酸溶液[7－8]（pH 為2.5）、甲醇－水[9]、乙腈－0.4%醋酸水溶液[10]（pH 為3.2）、乙腈－10 mmol／L 磷酸二氫鈉溶液（pH 為5.0）系統(tǒng)進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)有機(jī)相用甲醇時(shí)，比例提高至水－甲醇（50 ∶50，V／ V）時(shí)，淫羊藿苷峰保留時(shí)間為21.8 min，且供試品溶液主峰與前面雜質(zhì)峰未達(dá)到有效分離，顯示甲醇對目標(biāo)測定成分淫羊藿苷的洗脫能力比乙腈弱，故選有機(jī)相為乙腈。無論水相中加醋酸、磷酸或磷酸二氫鈉溶液，都與選用等比例純水時(shí)，淫羊藿苷主峰保留時(shí)間、峰形及分離度無差異，故選用水相為純水。淫羊藿苷水相比例微調(diào)，對保留時(shí)間影響較大，但調(diào)整比例在2%內(nèi)時(shí)，色譜峰形尖銳，其分離度均大于1.5。結(jié)合2015 年版《中國藥典(一部)》中淫羊藿中淫羊藿苷的含量測定方法，選定流動相比例為乙腈－水（30 ∶70，V／ V）。

3.3 耐用性考察

曾用色譜柱Zorbax SB －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）和HypersilTMGOLD 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），分離效果好，換用儀器Waters 2695 －2998 液相色譜儀、安捷倫1260 液相色譜儀、戴安U3000 液相色譜儀測得結(jié)果均相近，表明該方法耐用性較好，重復(fù)性強(qiáng)。

3.4 藥材轉(zhuǎn)移率

取制備九葉酒的淫羊藿藥材，測定藥材中淫羊藿苷含量，根據(jù)處方，計(jì)算得藥材轉(zhuǎn)移率為81.33%。