頸舒顆粒中有效成分含量測定

葉 慧，李 敏

（江蘇省泰州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 泰州 225300）

頸舒顆粒是一種常用于治療頸椎病的6 類中成藥，由三七、川芎、當(dāng)歸、肉桂、紅花、天麻、人工牛黃7 味中藥材組方。方中三七為君藥，化瘀、止痛、活血[1]；當(dāng)歸[2]、紅花[3]、川芎[4]共為臣藥，補(bǔ)血行氣，活血祛瘀，以增強(qiáng)三七的活血化瘀止痛效力；肉桂[5]、天麻[6]為佐藥，肉桂溫陽通脈，天麻入肝經(jīng)，善治風(fēng)寒濕痹、眩暈麻木、肢體拘攣；人工牛黃為使藥，由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、?；撬?、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成[7]5，70，173，開竅通絡(luò)，藥性寒涼[8]，加入藥性辛溫的肉桂，既可平衡其寒涼，又能助其開竅通絡(luò)之功效，引領(lǐng)各藥直達(dá)病所。其功能活血化瘀、溫經(jīng)、通竅、止痛，臨床主要用于神經(jīng)根型頸椎病瘀血阻絡(luò)證，癥見頸肩部僵硬、疼痛，患側(cè)上肢竄痛等[7]1568－1569，對(duì)于氣滯血瘀證型頸椎病有較好效果[9－10]，配合針灸、手法、理療等能提高療效[11－12]。其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收錄于2015 年版《中國藥典（一部）》，含量測定項(xiàng)下對(duì)三七藥材的人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1進(jìn)行了定量測定，以及人工牛黃中的膽酸進(jìn)行定量測定。在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，本研究中進(jìn)一步補(bǔ)充了含量測定項(xiàng)的不足，建立了頸舒顆粒中有效成分含量測定的高效液相色譜（HPLC）法，為后續(xù)質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity Arc 型高效液相色譜儀（包括Empower?3 工作站，四元梯度泵，2998 PDA 檢測器，自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱），Waters?e2695 Separations Module 型高效液相色譜儀（包括Empower?3 工作站，四元梯度泵，2424 ELS 檢測器，自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱），均購自美國Waters 公司；8200 型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為53 kHz）；Milli－Q型超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；XS105DU 型電子天平（瑞士Mettler 公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

三七皂苷R1對(duì)照品（批號(hào)為110745 －201318，純度為94.0%），人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)為110703 －201530，純度為91.7%），人參皂苷Re 對(duì)照品（批號(hào)為110754 －201626，純度為97.4% ），人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)為110704 －201424，純度為93.7%），人參皂苷Rd 對(duì)照品（批號(hào)為111818，純度為92.1%），膽酸對(duì)照品（批號(hào)為100078 －201415，純度為98.9%），豬去氧膽酸對(duì)照品（批號(hào)為100087 －200610，純度為99.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；頸舒顆粒（國藥集團(tuán)精方＜安徽＞藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為171202，171209，180631）；三七、當(dāng)歸、川芎、紅花、天麻、肉桂、人工牛黃藥材（市售，經(jīng)泰州市食品藥品檢驗(yàn)所仇雅靜主任中藥師鑒定為正品）；乙腈為色譜純（Fisher 公司）；甲醇為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 三七藥材中5 種成分含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters XBridge C18柱（250 mm ×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：A 為乙腈溶液，B 為水溶液，梯度洗脫，0 ～20 min 時(shí)20%A，20 ～45 min 時(shí)20%A ～46%A，45 ～55 min 時(shí)46%A ～55%A，55 ～60 min 時(shí)55%A，60 ～62 min 時(shí)55%A ～20%A，62 ～70 min 時(shí)20%A；流速：0.8 mL／min；柱溫：30 ℃；檢測波長：203 nm；進(jìn)樣量：10 μL。人參皂苷Rg1峰與人參皂苷Re 峰的分離度均大于1.5。

2.1.2 溶液制備

精密稱取三七皂苷R1對(duì)照品，人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rd 對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含三七皂苷R10.40 mg、人參皂苷Rg10.52 mg、人參皂苷Re 0.16 mg、人參皂苷Rb10.79 mg、人參皂苷Rd 0.72 mg 的混合對(duì)照品溶液。取樣品，研細(xì)，混勻，取2.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入30 mL 乙醚，振搖提取2 h[2]，過濾，濾渣揮干，精密量取40 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為250 W，33 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，蒸干，殘?jiān)?0 mL 水溶解，用水飽和正丁醇溶液萃取3 次，每次25 mL，合并正丁醇液，用水飽和正丁醇溶液洗滌2 次，每次25 mL，正丁醇液蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。取缺三七藥材的其他藥材，按頸舒顆粒標(biāo)準(zhǔn)制法煎煮、濃縮為陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺三七藥材的陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察[4]

專屬性試驗(yàn)：按擬訂色譜條件分別對(duì)2.1.2 項(xiàng)下3種溶液進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，對(duì)照品溶液出峰順序?yàn)槿咴碥誖1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd。結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)峰保留時(shí)間一致，陰性對(duì)照無干擾，且各組分相鄰成分之間分離度均較好（R ＞1.5）。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：取適量對(duì)照品，精密稱定，配成每1 mL含三七皂苷R10.74 mg、人參皂苷Rg12.62 mg、人參皂苷Re0.37mg、人參皂苷Rb12.75mg、人參皂苷Rd0.76mg的混合對(duì)照品溶液，稀釋2，3.33，5，10，20 倍[6]，分別進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表1。

精密度試驗(yàn)：取2.1.1 項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 色譜峰面積的RSD 分別為0.30%，0.47%，0.51%，0.40%，0.44%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為171202）適量，精密稱定，平行制備供試品溶液6 份，依法測定含量。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 的平均含量分別為1.46，2.95，0.38，1.92，1.45 mg ／g， RSD 分 別 為1.78% ，1.44% ，2.01% ，1.57%，1.67%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

圖1 三七高效液相色譜圖

表1 三七中5 種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為171202）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，18，24 h時(shí)進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 峰面積的 RSD 分 別 為1.40% ，0.13% ，0.95% ，1.21% ，0.56%（n ＝7），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為171202），研細(xì)，稱取6 份，每份1.0 g，精密稱定，加入混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度分別為三七皂苷R10.40 mg ／mL、人參皂苷Rg10.52 mg／mL、人參皂苷Re 0.16 mg ／mL、人參皂 苷Rb10.79 mg ／ mL、人 參 皂 苷Rd 0.71 mg ／ mL）2 mL，依法制備供試品溶液，定容至10 mL 容量瓶中，搖勻，即得。按擬訂色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果見表2。

2.1.4 樣品含量測定[10]

取3 批樣品，對(duì)比2015 年版《中國藥典(一部)》與本研究中改進(jìn)的提取方法制備供試品溶液，按外標(biāo)法分別計(jì)算3 批樣品中5 種成分的含量。結(jié)果見表3。

2.2 人工牛黃中膽酸、豬去氧膽酸含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC －C18柱（150 mm ×4.6 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：A 為乙腈溶液，B 為0.2%甲酸溶液，梯度洗脫，0 ～7 min 時(shí)5%A，7 ～20 min 時(shí)5%A ～80%A，20 ～25min 時(shí)80%A ～90%A，25 ～30min 時(shí)90%A ～96%A；流速：0.8 mL／min；柱溫：25 ℃；檢測器增益：10；氣體壓力：40 psi；噴霧器模式：加熱；功率級(jí)別：65%；漂移管溫度：60 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取膽酸、豬去氧膽酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含膽酸0.89 mg、豬去氧膽酸0.68 mg 的混合對(duì)照品溶液。取樣品適量，研細(xì)，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超聲處理（功率為250 W，頻率為50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺人工牛黃藥材的其他藥材，按頸舒顆粒標(biāo)準(zhǔn)制法煎煮、濃縮為陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備缺人工牛黃的陰性對(duì)照品溶液。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）

表3 3 批樣品中皂苷類成分含量測定結(jié)果（mg ／g）

圖2 人工牛黃高效液相色譜圖

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：按擬訂色譜條件分別對(duì)2.2.2 項(xiàng)下3種溶液進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，對(duì)照品溶液出峰順序?yàn)槟懰?、豬去氧膽酸。結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)峰保留時(shí)間一致，陰性對(duì)照無干擾，且各組分相鄰成分之間分離度均大于1.5。色譜圖見圖2。

線性關(guān)系考察：取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液進(jìn)行不同比例的稀釋，得系列線性對(duì)照品溶液，精密吸取各級(jí)對(duì)照品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件注入液相色譜儀，測得峰面積，以進(jìn)樣量對(duì)數(shù)值（X）為橫坐標(biāo)、峰面積對(duì)數(shù)值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y膽酸＝8.744 510 4 X膽酸－6.353 103，r ＝0.999 9；Y豬去氧膽酸＝7.101 810 4 X豬去氧膽酸＋6.619 103，r ＝0.999 4。膽酸和豬去氧膽酸進(jìn)樣量對(duì)數(shù)值分別在1.94 ～19.45 μg 和1.00 ～9.97 μg 范圍內(nèi)與峰面積對(duì)數(shù)值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取上述膽酸、豬去氧膽酸混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜峰面積。結(jié)果的RSD 分別為1.90%和1.35%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為171202）適量，精密稱定，依法平行制備供試品溶液6 份，按擬訂色譜條件測定。結(jié)果膽酸和豬去氧膽酸平均含量分別為11.63 mg／g，7.67 mg／g，RSD 分別為0.29%和1.27%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為171202）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h時(shí)進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果膽酸、豬去氧膽酸的RSD 分別為1.89%和1.92% （n ＝7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為171202），研細(xì)，稱取6 份，每份0.25 g，精密稱定，加入（膽酸質(zhì)量濃度為0.89 mg／mL、豬去氧膽酸質(zhì)量濃度為0.68 mg／mL）混合對(duì)照品溶液2 mL，依法制備供試品溶液，定容至10 mL 容量瓶中，搖勻，按擬訂色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取3 批樣品，依法制備供試品溶液，采用HPLC －蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)法和HPLC－紫外可見分光光度(UV)法分別按改進(jìn)方法和2015 年版《中國藥典(一部)》方法測定樣品中有效成分的含量。結(jié)果見表5。

表5 3 批樣品膽酸、豬去氧膽酸含量（mg ／g）

3 討論

3.1 三七藥材前處理考察

曾考察甲醇超聲、乙醚脫脂甲醇超聲、乙醚脫脂甲醇超聲再濃縮、乙醚脫脂甲醇超聲后正丁醇萃取4 種前處理方法。結(jié)果表明，經(jīng)過乙醚洗滌、甲醇提取、正丁醇萃取、蒸干定容等步驟，溶劑峰減小，皂苷成分出峰明顯，分離度高，峰型較好，且雜質(zhì)峰較少。

2015 年版《中國藥典(一部)》中三七含量測定項(xiàng)前處理（采用乙醚放置12 h，甲醇超聲提?。?，既浪費(fèi)時(shí)間，又不能充分提取三七中皂苷類活性成分；改進(jìn)后采用乙醚振搖提取，甲醇超聲提取、正丁醇萃取，既節(jié)約時(shí)間，又能提高活性成分的提取率。

3.2 人工牛黃藥材前處理考察

參考2015 年版《中國藥典（一部）》中頸舒顆粒含量測定項(xiàng)－人工牛黃，采用HPLC －UV 法，乙腈－0.2%磷酸水溶液（35 ∶65，V／ V），等度洗脫，色譜峰出峰快，且相應(yīng)低；考慮到膽酸、豬去氧膽酸紫外吸收均為末端吸收，于紫外波長192 nm 檢測時(shí)，靈敏度低。采用HPLC－ELSD 法，以乙腈－0.2%甲酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，基線穩(wěn)定，檢測的靈敏度更高。